糖尿病人的成骨細胞對臍帶間充質(zhì)干細胞成骨分化的影響.pdf

1、目的：
　　 觀察糖尿人來源的成骨細胞與胰島素對人臍帶間充質(zhì)干細胞成骨分化的影響，探討人臍帶間充質(zhì)干細胞治療糖尿病人骨折愈合延遲的可行性。
　　 方法：
　　 一、成骨細胞的分離與培養(yǎng):利用膠原酶消化法分離培養(yǎng)人成骨細胞，利用堿性磷酸酶鈣鈷法染色、Ⅰ型膠原蛋白免疫細胞化學染色、鈣結(jié)節(jié)茜素紅染色鑒定成骨細胞的特性。
　　 二、成骨細胞對臍帶間充質(zhì)干細胞成骨分化的影響:利用Transwell細胞培養(yǎng)板，間接共

2、培養(yǎng)成骨細胞與臍帶間充質(zhì)干細胞。實驗分三組，A組上室不加細胞作為陰性對照組;B組上室內(nèi)放置非糖尿病人來源的成骨細胞;C組上室內(nèi)放置糖尿病人來源的成骨細胞;三組下室內(nèi)均放置人臍帶間充質(zhì)干細胞。采用CCK-8法于第一周內(nèi)觀察臍帶間充質(zhì)干細胞的生長增殖情況;第10天時行免疫熒光染色，觀察Ⅰ型膠原蛋白的表達情況;第7、10、14天時利用細胞堿性磷酸酶活性比色法觀察臍帶間充質(zhì)干細胞內(nèi)的堿性磷酸酶活性表達情況;利用RT-PCR的方法在第21天時，觀

3、察臍帶間充質(zhì)干細胞內(nèi)骨鈣素mRNA的相對表達量。
　　 三、胰島素對臍帶間充質(zhì)干細胞分化的影響:實驗分為胰島素處理組與非胰島素處理組，利用CCK-8法觀察臍帶間充質(zhì)干細胞的增殖情況;細胞堿性磷酸酶活性比色法比較臍帶間充質(zhì)干細胞內(nèi)堿性磷酸酶活性;RT-PCR法比較臍帶間充質(zhì)干細胞內(nèi)Ⅰ型膠原蛋白mRNA、骨鈣素mRNA的相對表達量。
　　 結(jié)果：
　　 一、所培養(yǎng)的細胞表達堿性磷酸酶，Ⅰ型膠原蛋白和鈣結(jié)節(jié)，符合成骨細

4、胞的特征，同非糖尿病人來源的成骨細胞相比，糖尿病人來源的成骨細胞表達的堿性磷酸酶、Ⅰ型膠原蛋白、鈣結(jié)節(jié)量少。
　　 二、A組的臍帶間充質(zhì)干細胞的增殖較慢;B、C組的臍帶間充質(zhì)干細胞增殖較快，B組的細胞數(shù)量多于A、C兩組，三組間的差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。
　　 三、臍帶間充質(zhì)干細胞在第10天時行Ⅰ型膠原蛋白免疫熒光染色，A組為陰性，B、C組呈陽性，B、C兩組間的差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。
　　

5、四、A組堿性磷酸酶活性一直處于低表達狀態(tài)，同A組相比，B、C組堿性磷酸酶活性增加，10天時達到高峰，14天時表達降低，B、C組堿性磷酸酶活性表達趨勢相同，但C組表達量低，三組間的差異具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。
　　 五、在第21天時，RT-PCR檢測發(fā)現(xiàn)B、C組的臍帶間充質(zhì)干細胞內(nèi)表達骨鈣素基因，A組未檢測到骨鈣素基因的表達，C組表達量低于B組表達量，三組間的差異具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。
　　 六、同非胰島

6、素處理組相比，胰島素處理組臍帶間充質(zhì)干細胞的增殖加快，堿性磷酸酶活性增高，Ⅰ型膠原蛋白基因、骨鈣素基因表達量高，兩者間的差異具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。
　　 結(jié)論：
　　 糖尿病人來源的成骨細胞雖然功能受損，但是具有誘導臍帶間充質(zhì)干細胞成骨分化的能力，其誘導分化作用略差于非糖尿病人來源的成骨細胞。胰島素不僅能夠促進受損成骨細胞的功能恢復，并且促進臍帶間充質(zhì)干細胞的增殖和成骨分化。因此推測臍帶間充質(zhì)干細胞聯(lián)合胰島素移