PEI-SPIO-IL-15RβsiRNA納米復(fù)合物對類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎治療作用的研究.pdf

1、目的:在自身免疫疾病類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(RA)的發(fā)病過程中，IL-15可誘使巨噬細(xì)胞和T細(xì)胞活化，活化的T細(xì)胞和巨噬細(xì)胞通過相互作用可產(chǎn)生和分泌多種促炎因子、趨化因子和金屬蛋白酶等。因此，IL-15及其受體(IL-15R)可作為RA治療的理想靶標(biāo)。本研究以聚乙烯亞胺修飾的氧化鐵(PEI-SPIO)納米顆粒為載體，研究靶向IL-15受體β亞基(IL-15Rβ)的siRNA對佐劑型關(guān)節(jié)炎(AA)大鼠在體治療效果。
　　方法:將PEI-SP

2、IO納米顆粒與siRNA按照不同的質(zhì)量比室溫孵育后，采用瓊脂糖凝膠電泳遷移率實(shí)驗(yàn)選擇最佳結(jié)合比例，然后對以最佳比例結(jié)合形成的復(fù)合物進(jìn)行表征，測其平均粒徑大小和表面zeta電位。通過血清穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)檢測PEI-SPIO納米顆粒對siRNA的保護(hù)作用。通過MTS實(shí)驗(yàn)檢測結(jié)合siRNA后納米復(fù)合物(PEI-SPIO/siRNA)的細(xì)胞毒性。采用細(xì)胞普魯士藍(lán)染色和流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞對PEI-SPIO/siRNA納米顆粒的攝取效率。通過qPCR和W

3、estern blotting證實(shí)PEI-SPIO/IL-15Rβ siRNA能有效沉默IL-15RβmRNA和IL-15Rβ蛋白的表達(dá)。以大鼠佐劑型關(guān)節(jié)炎為人類類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的動(dòng)物模型，通過普魯士藍(lán)染色和近紅外活體成像檢測了PEI-SPIO/siRNA納米顆粒在AA大鼠體內(nèi)的生物分布。采用流式細(xì)胞術(shù)檢測體內(nèi)不同組織中CD11b+巨噬細(xì)胞和CD3+T細(xì)胞對PEI-SPIO/Cy3-siRNA納米顆粒的攝取情況。最后用PEI-SPIO/I

4、L-15Rβ siRNA納米顆粒對AA大鼠在體治療，通過關(guān)節(jié)炎指數(shù)評分、X-ray、HE染色對各治療組大鼠關(guān)節(jié)炎臨床指標(biāo)和組織病理變化進(jìn)行分析，采用qPCR分析炎性關(guān)節(jié)內(nèi)IL-15Rβ及炎癥因子TNFα、IL-1β、IL-15和金屬蛋白酶3(MMP3)mRNA的表達(dá)情況，評價(jià)PEI-SPIO/IL-15Rβ siRNA納米顆粒對類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎動(dòng)物模型在體治療效果。
　　結(jié)果:PEI-SPIO納米顆粒與siRNA在Fe:siRNA質(zhì)

5、量比≥4時(shí)可緊密結(jié)合，普魯士藍(lán)染色和流式檢測結(jié)果表明PEI-SPIO/siRNA納米顆?？梢员痪奘杉?xì)胞高效攝取，MTS實(shí)驗(yàn)說明PEI-SPIO/siRNA納米顆粒在0～100μgFe/mL范圍內(nèi)不具有細(xì)胞毒性。血清穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)說明PEI-SPIO納米顆粒確實(shí)可保護(hù)siRNA不被降解。qPCR和Western blotting結(jié)果證明PEI-SPIO納米顆?？筛咝мD(zhuǎn)運(yùn)siRNA進(jìn)入到細(xì)胞質(zhì)，并能有效釋放siRNA，從而發(fā)揮RNAi作用，有效

6、沉默靶基因表達(dá)。體內(nèi)組織普魯士藍(lán)染色和近紅外活體成像結(jié)果證明PEI-SPIO/siRNA復(fù)合物主要分布在關(guān)節(jié)炎癥部位。PEI-SPIO/siRNA納米顆粒在AA大鼠體內(nèi)細(xì)胞攝取分析，發(fā)現(xiàn)PEI-SPIO/siRNA納米顆粒很容易被關(guān)節(jié)炎癥部位的巨噬細(xì)胞和T細(xì)胞攝取，并且外加磁場增強(qiáng)了攝取效率。由治療效果可以得出PEI-SPIO/IL-15Rβ siRNA可以明顯減輕關(guān)節(jié)炎大鼠軟骨和骨質(zhì)的破壞，減輕組織炎癥細(xì)胞浸潤和滑膜增生，有效抑制IL

7、-15Rβ和炎癥細(xì)胞因子TNFα、IL-1β、IL-15和MMP3 mRNA的表達(dá)，并且外加磁場增強(qiáng)了PEI-SPIO/IL-15Rβ siRNA納米顆粒的治療效果。
　　結(jié)論:
　　(1)PEI-SPIO納米顆粒能與siRNA緊密結(jié)合，安全有效轉(zhuǎn)運(yùn)siRNA進(jìn)入細(xì)胞，并在細(xì)胞質(zhì)中釋放siRNA，從而發(fā)揮RNAi作用，因此PEI-SPIO納米顆?？梢宰鳛閟iRNA理想轉(zhuǎn)運(yùn)載體;
　　(2)靜脈注射PEI-SPIO/si

8、RNA納米顆粒后，PEI-SPIO/siRNA納米顆粒很容易在炎癥關(guān)節(jié)部位聚集，且能被炎癥關(guān)節(jié)處的巨噬細(xì)胞和T細(xì)胞攝取;
　　(3)PEI-SPIO/IL-15Rβ siRNA復(fù)合物能夠明顯減輕AA大鼠軟骨和骨組織破壞，緩解RA炎癥細(xì)胞浸潤，抑制IL-15Rβ和炎癥因子IL-1β、TNFα、MMP3、IL-15 mRNA的表達(dá);
　　(4)外加磁場增強(qiáng)了PEI-SPIO/IL-15Rβ siRNA納米顆粒在關(guān)節(jié)炎癥部位的聚集