AKT抑制劑MK-2206對胃癌細胞生長的影響及化療增敏作用.pdf

1、背景及目的:
　　磷脂酰肌醇-3-激酶(PI3K)及蛋白激酶B（AKT）所組成的信號通路與腫瘤增殖、凋亡、轉移、侵襲及血管生成密切相關。作為該通路的核心，異?；罨腁KT通過磷酸化其下游分子促進腫瘤惡性增殖及抵抗凋亡，并參與調節(jié)腫瘤對放化療及靶向治療的敏感性。特異性抑制AKT分子活化能有效阻斷PI3K/AKT信號通路，抑制腫瘤增殖，促進凋亡。研究顯示在胃癌內(nèi)PI3K/AKT通路亦處于異常激活狀態(tài)，活化的AKT不僅與胃癌的分化、淋巴

2、結轉移、惡性程度相關，而且促進了胃癌對化療藥物敏感性的降低。MK-2206作為新型的AKT變構抑制劑，能同時抑制AKT三種亞型，其抗腫瘤效果已在乳腺癌、肺癌、甲狀腺癌、鼻咽癌、結腸癌、肝癌等多種腫瘤的體外及體內(nèi)學實驗中得以驗證，但關于其在胃癌中的療效，文獻報道不多。
　　本研究目的是通過體外實驗探討MK-2206對胃癌細胞生長的影響，分析其與胃癌常用化療藥物聯(lián)用時藥物之間的聯(lián)合效應及增強化療藥物抗腫瘤機制，為臨床上聯(lián)合應用MK-2

3、206治療胃癌提供實驗依據(jù)。
　　方法:
　　1.不同濃度的MK-2206（0～32μmol/l）作用胃癌SGC-7901及MKN45細胞24，48，72小時。MTS法測定MK-2206對SGC-7901及MKN45細胞的OD490nm值。GraphPad Prism計算各時間段內(nèi)藥物IC50值。
　　2.MK-2206與化療藥物多柔比星及5-氟尿嘧啶均以2倍的稀釋梯度聯(lián)合作用于SGC-7901及MKN45細胞72小時

4、，MTS法測定各孔OD490nm值。GraphPadPrism計算聯(lián)合組IC50值，利用Chou-Talalay合并指數(shù)方法評價MK-2206聯(lián)合多柔比星或5-氟尿嘧啶對SGC-7901及MKN45生長抑制的聯(lián)合效應。
　　3.平板克隆形成實驗:1μmol/lMK-2206處理SGC-7901細胞10天，甲醇固定，龍膽紫染色，顯微鏡下觀察計數(shù)，計算SGC-7901細胞克隆形成率。
　　4.不同濃度MK-2206（0～16μm

5、ol/l）處理胃癌SGC-7901細胞3h和6h，western blot方法分析總AKT及磷酸化AKT表達量。采用1μmol/l MK-2206聯(lián)合不同濃度多柔比星（0～0.9μmol/l）或5-氟尿嘧啶（0～500μg/ml）處理SGC-7901，western blot檢測細胞內(nèi)AKT信號通路變化及凋亡相關蛋白PARP、cleaved-PARP,caspase3,7,9及cleaved-caspase3,7,9變化。
　　結

6、果:
　　1.MK-2206能有效抑制胃癌SGC-7901及MKN45細胞生長，但其對SGC-7901細胞的抑制作用于8μmol/l后開始明顯，對MKN45細胞的抑制作用于4μmol/l起明顯。Graphpad Prism軟件計算SGC-7901細胞及MKN45細胞24h藥物IC50值分別為23.08及19.85μmol/l;48h IC50值為13.95及13.14μmol/l;72hIC50值為8.870及8.939μmol/

7、l。
　　2.MK-2206能協(xié)同增強多柔比星及5-Fu對胃癌細胞SGC-7901及MKN45生長抑制作用，以對SGC-7901細胞抑制更加顯著。計算MK-2206與多柔比星和5-氟尿嘧啶聯(lián)合處理SGC-7901細胞的聯(lián)合指數(shù)CI分別為0.21和0.25;而對于MKN45細胞，計算聯(lián)合指數(shù)分別為0.60和0.71。
　　3.平板克隆形成實驗顯示對照組SGC-7901細胞克隆形成率為38.87±5.9％，1μmol/l MK-

8、2206組的克隆形成率為18.13±1.8％，兩組間差異具有統(tǒng)計學意義(P=0.004)。
　　4.Western blot檢測顯示1μmol/l MK-2206可在3h內(nèi)完全抑制SGC-7901細胞內(nèi)P-AKT表達。不同濃度多柔比星及5-氟尿嘧啶處理SGC-7901細胞后，細胞內(nèi)AKT可發(fā)生短暫的磷酸化水平增加。而加用1μmol/l MK-2206能有效抑制多柔比星及5-氟尿嘧啶處理所造成的P-AKT表達，同時通過增強caspa