mTOR抑制劑rapamycin聯(lián)合MEK抑制劑PD98059對胃癌細胞的協(xié)同作用與機制研究.pdf

1、目的:
　　1.比較分析胃癌細胞SGC-7901和正常胃黏膜上皮細胞GES-1中PI3K、AKT、mTOR、MEK、ERK等基因的表達差異，驗證PI3K/AKT/mTOR和MAPK/ERK信號通路在胃癌中的激活情況。
　　2.觀察mTOR抑制劑rapamycin對胃癌MGC-803細胞的影響，探討PI3K/AKT/mTOR信號通路調(diào)控胃癌細胞生長的可能分子機制，為該通路抑制劑應用于臨床提供更多的實驗依據(jù)。
　　3.觀察

2、并探討PD98059對胃癌SGC-7901細胞信號轉(zhuǎn)導的影響及其作用機制，以期為胃癌的基礎研究和臨床治療提供更多的實驗依據(jù)。
　　4.研究mTOR抑制劑rapamycin和MEK抑制劑PD98059聯(lián)合應用對胃癌SGC-7901細胞是否具有協(xié)同效應，探討PI3K/AKT/mTOR和MAPK/ERK信號通路的相互作用，揭示這兩條信號通路的相互調(diào)控機制，為制定胃癌基因水平的預防和治療以及為臨床研究新的靶向治療藥物及尋求新的聯(lián)合治療方案

3、提供學術依據(jù)。
　　方法:
　　1.體外培養(yǎng)人低分化胃癌細胞株SGC-7901和正常胃黏膜上皮細胞GES-1，實時熒光定量PCR技術測定PI3K/AKT/mTOR信號通路關鍵信號分子PI3K、AKT、mTOR和MAPK/ERK信號通路關鍵信號分子MEK、ERK等相關基因的mRNA表達;Western Blot法檢測總蛋白AKT、mTOR、MEK1/2、ERK1/2和磷酸化蛋白p-AKT、p-mTOR、p-MEK1/2、p-E

4、RK1/2的定量表達。
　　2.應用mTOR靶向抑制劑rapamycin干預胃癌細胞株MGC-803。MTT法檢測rapamycin對細胞增殖的影響;RT-qPCR測定PI3K、AKT、mTOR、4EBP、P70S6K等基因的mRNA表達;Western Blot檢測各總蛋白mTOR(Ser2448)、P70S6K和磷酸化蛋白p-mTOR(Ser2448)、p-P70S6K(Thr389)的定量表達;AnnexinⅤ-FITC/P

5、I染色結(jié)合流式細胞術檢測細胞周期分布和凋亡率變化。
　　3.應用MEK靶向抑制劑PD98059干預胃癌細胞株SGC-7901。CCK-8法檢測PD98059對細胞增殖活性的影響;RT-qPCR檢測MEK、ERK等基因的mRNA表達;Western Blot檢測各總蛋白MEK1/2、ERK1/2和磷酸化蛋白p-MEK1/2、p-ERK1/2的定量表達;流式細胞術檢測PD98059對SGC-7901細胞周期分布和凋亡率的影響。

6、　　4.根據(jù)rapamycin和PD98059抑制胃癌細胞的增殖實驗結(jié)果各選取一個藥物濃度點，設計單獨用藥及聯(lián)合用藥分組:對照組、rapamycin組、PD98059組、聯(lián)合組。RT-qPCR檢測PI3K/AKT/mTOR信號通路關鍵信號分子PI3K、AKT、mTOR和MAPK/ERK信號通路關鍵信號分子MEK、ERK等相關基因的mRNA表達。Western Blot檢測各組總蛋白AKT、mTOR、MEK1/2、ERK1/2和磷酸化蛋白

7、p-AKT、p-mTOR、p-MEK1/2、p-ERK1/2的定量表達。AnnexinⅤ-FITC/PI染色結(jié)合流式細胞術檢測單獨用藥及聯(lián)合用藥對SGC-7901細胞周期分布和凋亡率的影響。
　　結(jié)果:
　　1.PI3K/AKT/mTOR和MAPK/ERK通路關鍵信號分子在SGC-7901和GES-1細胞中的表達研究
　　RT-qPCR測定PI3K、AKT、mTOR、MEK、ERK基因的mRNA表達，擴增曲線良好，溶解

8、曲線表明特異性良好。SGC-7901細胞中的mRNA表達水平顯著高于GES-1細胞中的表達水平，具有顯著性差異(P＜0.05)。胃癌SGC-7901細胞和正常胃黏膜上皮細胞GES-1中總mTOR、AKT、MEK、ERK蛋白的表達水平組間無顯著性差異(P＞0.05)。但SGC-7901細胞中磷酸化蛋白p-mTOR、p-AKT、p-MEK、p-ERK蛋白的表達均顯著高于GES-1細胞，差異具統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。
　　2.mTO

9、R抑制劑Rapamycin對胃癌MGC-803細胞生物學功能的影響
　　與對照組相比，不同濃度rapamycin對MGC-803細胞均有抑制作用，且隨著rapamycin濃度的增加，MGC-803細胞增殖能力逐漸下降，抑制作用呈現(xiàn)劑量依賴性(P＜0.01)。實驗組的PI3K、AKT、mTOR、4EBP、P70S6K基因的mRNA表達與對照組相比，隨著rapamycin濃度升高，其表達量均逐漸降低(P＜0.01)。實驗組總蛋白mTO

10、R(Ser2448)、P70S6K表達無明顯差異，磷酸化蛋白p-P70S6K(Thr389)、p-mTOR(Ser2448)隨著抑制劑濃度的增加蛋白表達量逐漸降低(P＜0.05)。實驗組G0/G1期細胞比例逐漸上升，高于對照組(P＜0.01)，S期細胞比例均低于對照組(P＜0.01)，G2/M期細胞比例逐漸下降，均低于對照組(P＜0.01)。實驗組凋亡率高于對照組(P＜0.01)，且隨著濃度的增加而增加，呈現(xiàn)劑量依賴性。
　　3.

11、PD98059靶向抑制MAPK/ERK信號通路對胃癌SGC-7901細胞的影響
　　實驗組SGC-7901細胞增殖率均低于對照組(P＜0.01)。在一定范圍內(nèi)，隨著PD98059濃度的增加，SGC-7901細胞增殖能力逐漸下降，抑制作用呈現(xiàn)劑量依賴性。當抑制劑濃度達到200μmol/L時抑制作用趨緩，達到300μmol/L時進入平臺期，增值率無明顯變化，300μmol/L濃度組與400μmol/L濃度組間無差異(P＞0.05)。實

12、驗組的MEK、ERK基因的mRNA表達量均低于對照組(P＜0.01)。隨著PD98059濃度的增加，ERK基因的mRNA表達量逐漸下降，呈現(xiàn)劑量依賴性(P＜0.01)。50μmol/L濃度組MEK基因的mRNA表達量高于25μmol/L、100μmol/L濃度組，低于對照組。與對照組相比，25μmol/L濃度組MEK1/2蛋白表達無變化(P＞0.05)，而50μmol/L、100μmol/L濃度組表達高于對照組(P＜0.05);25μm

13、ol/L濃度組p-MEK1/2表達與對照組相比無明顯差異（P＞0.05），而50μmol/L、100μmol/L濃度組表達低于對照組(P＜0.05)，并呈現(xiàn)劑量依賴性;各濃度組總ERK1/2表達無顯著差異(P＞0.05)，而各組磷酸化蛋白p-ERK1/2隨著抑制劑濃度的增加蛋白表達量逐漸降低(P＜0.05)。與對照組相比，實驗組G0/G1期細胞比例逐漸上升，高于對照組(P＜0.01)，S期細胞比例逐漸升高，均低于對照組(P＜0.01)，

14、G2/M期細胞比例逐漸下降，均低于對照組(P＜0.01)。25μmol/L、50μmol/L濃度組凋亡率隨著濃度的增加而增加，呈現(xiàn)劑量依賴性(P＜0.01)，而50μmol/L和100μmol/L濃度組間凋亡率無統(tǒng)計學差異(P＞0.05)。
　　4.mTOR抑制劑Rapamycin聯(lián)合MEK抑制劑PD98059對胃癌細胞的協(xié)同作用及機制研究
　　rapamycin組和PD98059組的AKT、mTOR、MEK、ERK基因的m

15、RNA表達量均低于對照組（P＜0.05），聯(lián)合組的AKT、mTOR、MEK、ERK基因的mRNA表達量均低于各單獨用藥組(P＜0.05)。各組總AKT、mTOR、MEK1/2、ERK1/2蛋白表達量與對照組相比無明顯差異(P＞0.05)。rapamycin組和PD98059組磷酸化蛋白p-AKT、p-mTOR、p-MEK1/2、p-ERK1/2表達量均低于對照組(P＜0.05)。聯(lián)合用藥組磷酸化蛋白p-AKT、p-mTOR、p-MEK1

16、/2、p-ERK1/2表達量均低于rapamycin組和PD98059組(P＜0.05)。
　　結(jié)論:
　　1.PI3K/AKT/mTOR和MAPK/ERK信號通路在胃癌SGC-7901細胞中處于激活狀態(tài)，這兩條信號通路的異常改變與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關。
　　2.mTOR靶向抑制劑rapamycin對PI3K/AKT/mTOR信號通路關鍵基因的轉(zhuǎn)錄和翻譯過程有抑制作用，并抑制了胃癌細胞的增殖活性，將細胞周期阻滯于G

17、0/G1期，引起細胞凋亡，從而抑制胃癌細胞的生長，揭示了PI3K/AKT/mTOR信號通路與胃癌化療效果的相關性。
　　3.MEK靶向抑制劑PD98059可以通過抑制MAPK/ERK信號通路影響細胞的生物學活性，抑制胃癌細胞增殖，使細胞發(fā)生G0/G1期阻滯，并促進細胞凋亡，最終使胃癌細胞的生長受到抑制。說明MAPK/ERK信號通路抑制劑PD98059可以作為有效的抗癌藥物應用于臨床。深入研究MAPK/ERK信號通路在腫瘤發(fā)生發(fā)展中