酒精導(dǎo)致的精子異常與子代出生缺陷的關(guān)系及機(jī)制研究.pdf

1、1973年，西雅圖的研究人員Jones和Smith公布了一系列孕期酒精暴露相關(guān)癥狀的研究結(jié)果，并將其正式命名為胎兒酒精中毒綜合癥(Fetal AlcoholSyndrome，F(xiàn)AS)。自此以后，越來越多的研究者加入到孕期酒精暴露引起的胎兒出生缺陷的研究中。在機(jī)制方面，關(guān)于胎兒酒精中毒綜合征的遺傳學(xué)及表觀遺傳學(xué)機(jī)制也有越來越多的報(bào)道。相比之下，男性長(zhǎng)期酗酒導(dǎo)致后代出生缺陷的研究卻極少。在有限的動(dòng)物學(xué)研究中，由于酒精量、年齡及品種的差異，酒

2、精導(dǎo)致雄性小鼠后代出生缺陷的表型不一，機(jī)制研究尚未涉及。盡管人們猜測(cè)，酒精作為環(huán)境致畸因子可能通過表觀遺傳學(xué)改變而致使后代發(fā)生出生缺陷，但迄今為止，父系酒精暴露導(dǎo)致胎兒酒精綜合癥的表觀遺傳學(xué)機(jī)制卻鮮有報(bào)道。
　　本研究擬從表觀遺傳學(xué)角度將酒精導(dǎo)致精子異常與后代出生缺陷相聯(lián)系，先建立雄性動(dòng)物長(zhǎng)期酒精暴露導(dǎo)致的后代出生缺陷模型，再通過各種表觀遺傳學(xué)分析技術(shù)檢測(cè)父本精子以及后代各組織的表觀遺傳修飾變化，以回答酒精究竟是否可以通過父系精子

3、的表觀遺傳學(xué)變異導(dǎo)致后代發(fā)生出生缺陷這個(gè)關(guān)鍵的科學(xué)問題，并力爭(zhēng)明確部分分子機(jī)制。
　　本研究分為以下四個(gè)部分:
　　一、通過對(duì)雄性KM，C57及Aldh2-/-小鼠進(jìn)行為期1個(gè)月的梯度酒精(0g/kg，1g/kg和3.3g/kg)灌胃處理，檢測(cè)小鼠體重、睪丸重量、附睪重量、精子密度以及精子活力等參數(shù)，對(duì)不同雄性小鼠長(zhǎng)期酒精暴露對(duì)其生殖毒性影響進(jìn)行研究。
　　二、三種實(shí)驗(yàn)小鼠與正常雌鼠雜交，獲得F1代小鼠，通過對(duì)其存活率

4、、畸形率、體重及性別比統(tǒng)計(jì)觀察F1代小鼠生長(zhǎng)發(fā)育情況;待F1代小鼠8周齡后，對(duì)其進(jìn)行高架十字、懸尾實(shí)驗(yàn)和水迷宮實(shí)驗(yàn)，對(duì)其焦慮抑郁情緒及認(rèn)知能力進(jìn)行評(píng)測(cè)。
　　三、通過MassArray EpiTYPER甲基化平臺(tái)，對(duì)酒精處理KM小鼠F0代精子、F1和F2代大腦皮層4個(gè)印跡基因（H19，Peg3，Ndn及Snrpn）DMR區(qū)的甲基化水平進(jìn)行研究，并用QRT-PCR檢測(cè)其大腦皮層中mRNA水平表達(dá)情況。
　　四、使用酶切甲基化測(cè)

5、序(MSCC)方法對(duì)酒精處理的C57小鼠F0代精子和F1代海馬組織進(jìn)行全基因組DNA甲基化分析，再利用表達(dá)譜芯片對(duì)F1代海馬組織進(jìn)行全轉(zhuǎn)錄組進(jìn)行檢測(cè)，最后用生物信息學(xué)進(jìn)行分析和篩選，挑選酒精處理后C57小鼠F0和F1代啟動(dòng)子區(qū)域甲基化變化與F1代mRNA表達(dá)相一致的基因，利用MassARRAY以及QRT-PCR方法在C57小鼠和Aldh2-/-小鼠F0及F1代中，進(jìn)行擴(kuò)大樣本的DNA甲基化和mRNA水平驗(yàn)證。
　　研究結(jié)果如下:<

6、br>　　一、3.3g/kg酒精處理的F0代KM小鼠體重顯著下降(p＜0.05)，精子密度及精子活力呈減少趨勢(shì);3.3g/kg酒精處理的C57和Aldh2-/-小鼠，其體重、睪丸和附睪重量均減少(p＜0.05)，精子密度呈減少趨勢(shì);隨著酒精處理劑量的增加，兩種小鼠睪丸內(nèi)精子凋亡率增加(p＜0.05);與C57小鼠酒精處理組比較，Aldh2-/-小鼠對(duì)酒精敏感性更高，后者的死亡率高于前者;3.3g/kg酒精處理的Aldh2-/-小鼠，其睪

7、酮激素、精子平均路徑速度（VAP）及平均曲線速度(VCL)均顯著減少(p＜0.05)。
　　二、對(duì)于酒精處理的三種小鼠，其F1代存活率下降(p＜0.05)，認(rèn)知、焦慮和抑郁程度均受到不同程度影響。酒精處理的KM小鼠F1代中出現(xiàn)了耳聾與急速轉(zhuǎn)圈兩種小鼠;與對(duì)照組比較，酒精處理組F1代KM小鼠學(xué)習(xí)記憶能力顯著下降，焦慮抑郁情緒增加(p＜0.05)。酒精處理的F1代Aldh2-/-小鼠，其認(rèn)知及抑郁情緒受影響程度高于酒精處理的C57小鼠

8、F1代。
　　三、在KM小鼠印跡基因甲基化檢測(cè)中，我們觀察到F0代雄性小鼠的精子中，高劑量酒精處理后H19與Peg3基因DMR區(qū)甲基化改變顯著(p＜0.05);在F1代小鼠大腦皮層中，Peg3基因的CpG7與CpG11兩個(gè)位點(diǎn)的甲基化變化與F0代精子中相同，有顯著性差異(p＜0.05)。Snrpn基因在F1代及F2代大腦皮層中觀察到甲基化顯著減少(p＜0.05)。其它印跡基因在F1代均未發(fā)現(xiàn)顯著的甲基化改變。4個(gè)印跡基因在F1代大

9、腦皮層mRNA水平檢測(cè)顯示，酒精處理組Peg3基因mRNA表達(dá)有減少趨勢(shì)，Snrpn基因有增加趨勢(shì)，但均無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。
　　四、利用酶切甲基化測(cè)序技術(shù)(MSCC)結(jié)合表達(dá)譜芯片對(duì)不同劑量酒精處理后C57 F0代精子及F1代海馬組織全基因組啟動(dòng)子區(qū)域進(jìn)行甲基化檢測(cè)和轉(zhuǎn)錄組進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)F0代甲基化改變且穩(wěn)定遺傳給F1代，且表達(dá)水平與甲基化程度相對(duì)應(yīng)的基因有12個(gè)。將這些基因在C57、Aldh2-/-小鼠F0及F1代中擴(kuò)大樣本進(jìn)行甲基