三氧化二砷誘導血小板凋亡及其相關(guān)機制探討.pdf

1、目的:
　　探討臨床使用濃度的三氧化二砷(Arsenic trioxide,ATO)是否會誘導血小板凋亡,并研究ATO誘導血小板凋亡的信號傳導機制。
　　方法:
　　收集健康志愿者新鮮靜脈全血,分離得到洗滌血小板及富含血小板血漿(Platelet rich plasma,PRP)。洗滌血小板(3×108/ml)與不同濃度ATO或者陰性對照二甲基亞砜(Dimethyl sulfoxide,DMSO)于37℃孵育5小時,使

2、用流式細胞儀檢測血小板線粒體跨膜電位(Mitochondrial inner transmembrane potential,ΔΨm)變化、磷脂酰絲氨酸(Phosphatidylserine,PS)外翻、血小板活化指標P-選擇素(P-Selectin)及血小板激活復合物(Patelet activated complex-1,PAC-1)的結(jié)合率。使用Western blot檢測ATO與正常人洗滌血小板孵育后血小板促凋亡蛋白Bax,抗凋

3、亡蛋白Bcl-2、Bcl-XL的表達和caspase-3的活化情況。為了探明c-Jun氨基末端激酶(c-jun NH2-terminal kinase,JNK)蛋白家族在ATO誘導的血小板凋亡過程中的作用,我們使用JNK蛋白特異性抑制劑雙香豆素抑制JNK蛋白活性,之后使用流式檢測ATO誘導的血小板ΔΨm的變化。同時我們研究了ATO對不同致聚劑誘導血小板聚集功能的影響,探討ATO對血小板功能有無損傷,將PRP與ATO(2μM)或者陰性對照

4、(DMSO)于37℃孵育1小時,洗滌血小板與ATO(16μM)或陰性對照(DMSO)于37℃孵育2小時后,PRP中加入膠原(Collagen,5μg/mL)或者二磷酸腺苷(Adenosine diphosphate,ADP,10μmol/L),洗滌血小板中加入凝血酶(Thrombin,0.5U/mL),1000rpm剪切力的情況下,使用血小板聚集儀檢測血小板聚集程度。ATO治療相關(guān)血小板減少已經(jīng)在臨床中被大量報道,為了探明ATO是否會引

5、起循環(huán)血小板計數(shù)減少,我們通過連續(xù)注射臨床使用濃度的ATO至實驗小鼠體內(nèi),之后使用Sysmex KX-21N血細胞計數(shù)儀測定小鼠血小板計數(shù),研究ATO對C57小鼠外周血血小板數(shù)量有無影響。
　　結(jié)果:
　　1.ATO誘導血小板凋亡
　　體外研究結(jié)果顯示,與正常陰性對照相比,ATO劑量依賴性誘導血小板ΔΨm去極化以及PS外翻,Western blot檢測ATO與正常人洗滌血小板孵育后,血小板抗凋亡蛋白Bcl-2、Bcl-

6、XL下調(diào),促凋亡蛋白Bax增強表達,ATO劑量依賴性誘導血小板caspase-3活化裂解,且ATO劑量依賴性引起JNK活化,使用JNK特異性抑制劑雙香豆素可以抑制ATO誘導的血小板ΔΨm去極化,然而雙香豆素并不能完全抑制這一過程,提示可能有其它信號途徑參與這一過程。以上實驗結(jié)果表明,ATO通過caspase依賴的線粒體途徑誘導血小板凋亡。
　　2.ATO損傷血小板聚集功能
　　既往研究表明,ATO抑制花生四烯酸、腎上腺素、凝

7、血酶以及U46619誘導的血小板聚集,然而對于膠原誘導的血小板聚集存在不同的觀點。我們通過研究表明,ATO抑制膠原、ADP以及凝血酶誘導的血小板聚集,提示ATO損傷血小板的聚集功能。
　　3.小鼠體內(nèi)實驗
　　大量研究表明,ATO治療急性早幼粒細胞白血病(Acute promyelocytic leukemia,APL)或者其他惡性腫瘤過程中常伴隨血小板減少。然而,相關(guān)機制仍不清楚。我們上述研究已經(jīng)表明,ATO在體外能夠誘導

8、血小板凋亡,為了進一步探明ATO是否對循環(huán)血小板計數(shù)產(chǎn)生影響,臨床治療相關(guān)劑量的ATO或0.9％生理鹽水(Normal saline,NS)對照通過腹腔注射C57小鼠,連續(xù)5天,之后使用血細胞計數(shù)儀測定外周血血小板計數(shù)變化。實驗表明,通過連續(xù)腹腔注射臨床使用濃度的ATO使小鼠外周血血小板計數(shù)發(fā)生減少。
　　結(jié)論:
　　綜上所述,ATO通過caspase依賴的線粒體途徑誘導血小板凋亡,JNK蛋白家族在其中發(fā)揮重要作用,ATO不