宮頸上皮內(nèi)瘤變中E-cadherin，β-catenin的表達與HPV16-18感染的關(guān)系.pdf

1、宮頸癌(cervical cancer，CC)是婦女最常見的惡性腫瘤之一，現(xiàn)已確認高危型人乳頭瘤病毒(high risk human papillomavirus，HR—HPV)是宮頸癌形成最重要的危險因子，99.7％的浸潤性宮頸癌中可以檢測到HR—HPV的存在。因此，通過高危HPV的檢測來篩查易患人群，追蹤HPV感染狀態(tài)，隨訪HPV是否被清除，是預防宮頸癌發(fā)生的關(guān)鍵。但并非所有感染HPV的患者都會發(fā)展為宮頸癌，僅檢測到患者感染了HPV

2、而不進一步檢查就無法了解宮頸病變的程度和發(fā)展趨勢。E—cadherin是一類介導細胞—細胞間黏附、具有維持組織結(jié)構(gòu)完整性和極性的鈣依賴性跨膜蛋白。E—cad的功能不僅需鈣離子存在，還需要與其配體連接素(catenin，cat)結(jié)合成復合體才能起作用，β—cat與E—cad直接結(jié)合，α—cat介導E—cad/β—cat與細胞骨架的肌動蛋白相連。故對維持上皮細胞的極性及分化起到重要作用，E—cadherin功能下降或缺失可能導致細胞—細胞間

3、黏附作用的降低，從而導致腫瘤的發(fā)生，發(fā)展．在宮頸上皮內(nèi)病變(cervical intraepithelial neoplasia，CIN)和宮頸癌中呈低表達，在正常對照組高表達，因此如果通過對宮頸癌病因?qū)W因素HPV和生物標志物因素E—cadherin，β—catenin的聯(lián)合檢測，來對宮頸癌高危人群進行篩查，可能具有重要意義。本研究對93例宮頸液基細胞殘液標本應用導流雜交HPV—DNA檢測技術(shù)檢測HPV各亞型的表達，并對相應組織組織學標

4、本用免疫組化法檢測E—cadherin，β—catenin，以探討二者在子宮頸癌發(fā)生發(fā)展中的生物學意義及臨床應用價值，試圖為提高宮頸癌易患人群檢出率，進而為宮頸癌的預警和早期診斷提供更科學有效的方法，達到早診早治，降低宮頸癌發(fā)病率死亡率的目的；并為開發(fā)簡便易得的分子篩查技術(shù)資源提供理論基礎(chǔ)。 材料和方法: 一、材料 (一)研究對象 600例宮頸液基細胞學殘液標本，均經(jīng)LCT(Liquid—based Cy

5、tology Test，LCT系統(tǒng))診為宮頸上皮內(nèi)病變及宮頸癌，來自2007年9月～2008年10月中國醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院婦科。無宮頸手術(shù)史、未孕、無盆腔放射治療史，年齡26～77歲，平均年齡48.4歲。40例子宮頸癌、40例CIN患者及13例對照組其中子宮頸浸潤癌40例、CINⅡ—Ⅲ19例、CINⅠ21例。 (二)主要試劑、儀器和來源 鼠抗人HPV16/18 E6抗體和羊抗鼠IgG—HRP抗體，鼠抗人E—cadher

6、in，β—catenin抗體均購自美國Santa Cruz公司。HPV—DNA分型檢測試劑盒購自凱普公司。免疫組化S-P試劑盒和DAB顯色試劑盒購自福州邁新生物技術(shù)有限公司。 二、方法 (一)免疫組織化學染色 用鏈霉素抗生物素蛋白—過氧化物酶免疫組化法(S-P法)檢測E—cadherin，β—catenin的表達。結(jié)果判定：E—cadherin，β—catenin蛋白定位于細胞膜，胞膜內(nèi)見棕黃色顆粒為陽性。由3名

7、有經(jīng)驗的病理醫(yī)師在雙盲法下獨立計數(shù)。細胞涂片主要計數(shù)有病變的細胞，異常宮頸上皮細胞著色大于10％則判定為陽性標本[5]。細胞片和組織片在光鏡下根據(jù)著色范圍分為：陽性細胞數(shù)小于10～24％為(+)；陽性細胞數(shù)25～49％為(++)；陽性細胞數(shù)50～74％為(+++)；陽性細胞數(shù)大于75％為(++++)。 (二)原位雜交 檢測HPV16/18DNA的表達。細胞核內(nèi)出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽性。陽性細胞數(shù)小于25％為(+)；陽性細胞數(shù)

8、25％～49％為(++)；陽性細胞數(shù)50％～74％為(+++)；陽性細胞數(shù)75％～100％為(++++)． (三)導流雜交HPV—DNA分型檢測 檢測HPV—DNA各亞型的表達．在檢測結(jié)果模板上相應亞型區(qū)域內(nèi)出現(xiàn)實心圓點即為該亞型陽性表達． (四)western HPV蛋白提?。簩⑹⒂袠颖镜脑嚬苤糜谒楸希贸暺扑闄C破碎細胞，4℃12000/g離心，45 min。取上清液，定量、備用。電泳、顯色：采用

9、十二烷基硫酸鈉變性聚丙烯酰胺凝膠不連續(xù)緩沖系統(tǒng)，先后配制15％的分離膠和5％濃縮膠；取蛋白樣品，上樣20μl(約含蛋白60μg)，電泳后將醋酸纖維素膜鋪到膠上進行轉(zhuǎn)印，42v，2h．加入一抗(1：200)過夜，加入二抗(1：2000)37℃，DAB顯色3～5 min。該膜上有顯色帶出現(xiàn)為陽性；若無顯色，為陰性表現(xiàn)。 (五)統(tǒng)計學分析 對所得結(jié)果各組間采用X2檢驗及Fisher's確切概率法檢驗，P<0.05有統(tǒng)計學意義．

10、 結(jié)果: 一、免疫組化法檢測E—cadherin，β—catenin的表達 E—cadherin，在細胞膜內(nèi)出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽性，β—catenin在細胞膜內(nèi)出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽性，過表達時胞核胞漿均著色，周圍正常結(jié)締組織、血管、間質(zhì)細胞顯示弱的著色。 E—cadherin，在正常宮頸脫落細胞及宮頸組織中高表達，在各組宮頸病變中有不同程度的表達：E—cadherin，在正常，CIN，浸潤癌中的表達率分別為8

11、4.6％(11/13)，72.5％(29/40)，27.5％(11/40)，β—catenin在正常，CIN，浸潤癌中的表達率分別為76.9％(10/13)，67.5％(27/40)，32.5％(13/40)。隨著宮頸上皮病變程度的加重呈現(xiàn)減低的趨勢 二、原位雜交法檢測HPV16/18 DNA的表達 HPV16/18在細胞核內(nèi)出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽性，部分病例可在胞漿中見到棕黃色顆粒。 HPV16/18在正常宮頸脫落

12、細胞中及相應組織中不表達或弱表達，在各組宮頸病變中有不同程度的表達：在正常、CIN和宮頸癌中，HPV16/18的陽性率分別為15.4％(2/13)、50.0％(20/40)和82.5％(33/40)，隨著宮頸上皮病變程度的加重呈現(xiàn)增高的趨勢。 三、導流雜交HPV—DNA分型檢測技術(shù)檢測HPV各亞型的表達 HPV—DNA各亞型在檢測結(jié)果模板相應亞型區(qū)域內(nèi)出現(xiàn)實心圓點，即為該亞型陽性． HPV—DNA各亞型在正常宮頸

13、脫落細胞中不表達或弱表達，在各組宮頸病變中有不同程度的表達：600例患者HPV檢測陽性共245例，陽性率為40.83％(245/600)，其中包括復合感染，具體感染情況見表1.表2.在HPV21種亞型中，除了HPV43，HPV44外有19種亞型被檢出，感染率最高的是HPV16(87/245)，其它常見型別為HPV58(36/245)，由此可見我省婦女感染HPV主要亞型是HPV16，HPV58及HPV6。 四、Western法檢測

14、HPV16/18的表達 HPV16/18在正常、CIN和宮頸癌中，陽性率分別為23.1％(3/13)，62.5％(25/40)，85％(34/40)。隨著宮頸上皮病變程度的加重呈現(xiàn)增高的趨勢。 結(jié)論: 1.E—cadherin，β—catenin在宮頸上皮內(nèi)病變及宮頸癌中，隨著病變程度的加重而陽性率減低。 2.HPV16/18的陽性率在宮頸上皮內(nèi)病變及宮頸癌中，隨著病變程度的加重而檢出率增高。 3

15、.E—cadherin的表達和HPV16/18的感染在宮頸病變中呈負相關(guān)，二者聯(lián)合檢測可提高宮頸病變篩查的準確度。 4.Western—blot檢測HPV16/18E6具有較高的靈敏性，尤其是在CIN組，適合于對宮頸疑難病例的檢測，作為HPV16/18檢測的輔助手段。 5.HPV16/18，在宮頸液基細胞學殘液和相應組織中的檢測結(jié)果都是基本一致的，作為宮頸病變檢測的輔助手段。 6.導流雜交HPV—DNA分型檢測我