骨橋蛋白在同種異基因小鼠皮膚移植中的作用.pdf

1、研究背景：
　　 骨橋蛋白(Osteopontin,OPN)是一種分布于細(xì)胞外基質(zhì)中的、含精氨酸.甘氨酸-天冬氨酸(Arg-Gly-Asp(RGD))三肽序列的分泌型酸性非膠原糖蛋白。這種蛋白最初是從骨基質(zhì)中分離出來的,廣泛存在于各種組織和體液中,包括子宮、胎盤、腎、平滑肌、一些腫瘤組織、白細(xì)胞、乳汁、血液。各種不同的免疫細(xì)胞,如激活的T細(xì)胞和抗原提呈細(xì)胞,均可以分泌OPN。OPN的不同分布表明它的功能的多樣性。OPN在骨組織礦

2、化、細(xì)胞粘附、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、細(xì)胞免疫、血管重塑等方面具有多種生物學(xué)功能。OPN作為重要的粘附和信號(hào)傳導(dǎo)分子,它通過RGD基序和CD44受體相互作用,介導(dǎo)細(xì)胞間的粘附和信號(hào)傳導(dǎo)。OPN與CD44結(jié)合,能參與巨噬細(xì)胞的趨化和粘附及炎癥反應(yīng)的介導(dǎo)。OPN還是一種細(xì)胞生存因子,能夠保護(hù)細(xì)胞不發(fā)生凋亡。抗OPN的單克隆抗體能促進(jìn)激活的T細(xì)胞發(fā)生凋亡。OPN在細(xì)胞介導(dǎo)的免疫反應(yīng)中同樣起到重要作用:機(jī)體發(fā)生炎癥反應(yīng)時(shí),炎癥性細(xì)胞表達(dá)的OPN尚可調(diào)節(jié)巨噬細(xì)

3、胞和單核細(xì)胞的功能。
　　 雖然OPN能介導(dǎo)很多生物學(xué)功能,但是在移植領(lǐng)域的研究還很少。如果利用抗OPN抗體或者敲除體內(nèi)的OPN,會(huì)不會(huì)影響T細(xì)胞的作用?OPN作為重要的炎癥因子,是否也在小鼠移植排斥反應(yīng)中發(fā)揮作用?這些問題都尚無研究。
　　 凋亡(apoptosis)和壞死(necrosis)是細(xì)胞的兩種主要死亡方式。細(xì)胞凋亡又稱程序化死亡,是生物體內(nèi)普遍存在的生理和病理現(xiàn)象,其特點(diǎn)是細(xì)胞主動(dòng)的、程序化的和耗能的死亡,

4、表現(xiàn)為核固縮、細(xì)胞皺縮、磷脂酰絲氨酸(phosphatidylserine,PS)外翻、凋亡小體形成。凋亡細(xì)胞的細(xì)胞膜不破裂,不引起炎癥反應(yīng)。壞死是細(xì)胞受到各種化學(xué)、物理或生物等因素的危害而發(fā)生的非程序化的、被動(dòng)的和破壞性的細(xì)胞死亡過程,其表現(xiàn)為細(xì)胞能量代謝中止,細(xì)胞膜通透性增高。壞死細(xì)胞腫脹或破裂,內(nèi)容物釋放到周圍組織中,引起炎癥反應(yīng)。
　　 細(xì)胞凋亡在維持機(jī)體自身耐受中起重要作用。近些年來,凋亡細(xì)胞對(duì)免疫系統(tǒng)的調(diào)節(jié)作用受到越

5、來越多的重視。凋亡細(xì)胞誘導(dǎo)免疫耐受也已被廣泛的實(shí)驗(yàn)證明。有研究已經(jīng)發(fā)現(xiàn)體外凋亡細(xì)胞可顯著抑制T細(xì)胞活化,靜脈輸注供者凋亡細(xì)胞可抑制針對(duì)供者移植抗原的特異性淋巴細(xì)胞增殖；靜脈注射供者凋亡細(xì)胞可不需要應(yīng)用免疫抑制劑,明顯延長心臟、皮膚和肝臟移植物存活。凋亡細(xì)胞誘導(dǎo)免疫耐受主要通過受者的吞噬細(xì)胞介導(dǎo),當(dāng)細(xì)胞發(fā)生凋亡時(shí)專職遞呈細(xì)胞,如巨噬細(xì)胞或樹突狀細(xì)胞,迅速吞噬凋亡細(xì)胞,防止凋亡細(xì)胞的胞內(nèi)容物釋放入周圍組織。供者凋亡細(xì)胞在靜脈注射后主要聚集于

6、受者肝臟,并在肝臟局部誘導(dǎo)Th2細(xì)胞應(yīng)答。
　　 因?yàn)镺PN可以促進(jìn)激活的T細(xì)胞存活,凋亡細(xì)胞可以抑制T細(xì)胞的活化,所以我們敲除OPN蛋白并研究其能否與凋亡細(xì)胞發(fā)揮協(xié)同作用,使小鼠同種異基因皮膚移植后的排斥反應(yīng)減弱,并進(jìn)一步探討OPN在小鼠同種異基因皮膚移植中的作用。
　　 皮膚移植作為一種操作簡單的移植模型,已經(jīng)被廣泛用于移植免疫的研究。在皮膚移植排斥反應(yīng)中,特異性輔助性T細(xì)胞(Th)和細(xì)胞毒性T細(xì)胞(CTL)被激活。

7、皮膚移植物和宿主之間抗原性差異決定這些特異性Th和CTL細(xì)胞的細(xì)胞表面表型。皮膚移植排斥反應(yīng)的早期階段,主要是供者抗原遞呈細(xì)胞參與,并介導(dǎo)急性排斥反應(yīng)；皮膚移植排斥反應(yīng)的后期階段,主要是受者抗原遞呈細(xì)胞參與,并介導(dǎo)慢性排斥反應(yīng)。我們根據(jù)國內(nèi)外關(guān)于皮膚移植的文獻(xiàn)報(bào)道,按照幾種常用的小鼠皮膚移植方法建立自體模型,以自體移植物存活作為判定小鼠皮膚移植技術(shù)成功的標(biāo)準(zhǔn)。選擇其中移植物存活率最高、操作相對(duì)簡單的方法制作研究所需的異種移植動(dòng)物模型。<

8、br>　　 目的：
　　 1.建立小鼠皮膚移植模型；
　　 2.研究OPN對(duì)小鼠皮膚移植排斥反應(yīng)的影響；
　　 3.研究OPN敲除聯(lián)合供者凋亡細(xì)胞靜脈注射對(duì)小鼠皮膚移植排斥反應(yīng)的影響。
　　 方法
　　 1.確定小鼠皮膚移植的方法
　　 移植物為供者的背部、耳部和尾部皮膚。移植床為受者的背部、側(cè)部。移植物和移植床在各種不同的組合下匹配:背部皮膚對(duì)背部移植床、背部皮膚對(duì)側(cè)部移植床；耳部皮膚

9、對(duì)背部移植床、耳部皮膚對(duì)側(cè)部移植床；尾部皮膚對(duì)背部移植床、尾部皮膚對(duì)側(cè)部移植床。
　　 供、受者小鼠麻醉后準(zhǔn)備移植皮片和移植床,對(duì)合完畢、四角縫合,凡士林紗布和無菌紗布覆蓋,醫(yī)用通氣透明膠帶固定。移植術(shù)后第7天拆除繃帶,觀察皮片存活情況,判定皮膚移植技術(shù)是否成功。
　　 2.通過腹腔注射抗OPN的單克隆抗體23C3,研究OPN對(duì)小鼠皮膚移植排斥反應(yīng)的影響
　　 a)動(dòng)物分組:受者C57BL/6小鼠,按照體重、年齡

10、和性別相同的情況,隨機(jī)分為三個(gè)大組:未處理對(duì)照組6只小鼠；腹腔注射IgG組18只小鼠和腹腔注射抗OPN的單克隆抗體23C3組18只小鼠。其中腹腔注射IgG組根據(jù)注射劑量的不同,又分為100μg、200μg和400μg三個(gè)小組,每小組有6只小鼠。腹腔注射單抗23C3組根據(jù)注射劑量分為100μg、200μg和400μg三個(gè)小組,每組有6只小鼠。
　　 b)皮膚移植:取供者小鼠的尾部皮膚,移植至受者小鼠的側(cè)部。四角縫合、固定包扎。皮膚

11、移植后第7天拆除繃帶逐日觀察皮膚移植皮片存活情況。
　　 c)注射劑量及方法:分別在皮膚移植術(shù)的第-1天、第1天、第3天、第5天和第7天腹腔注射IgG和抗OPN的單克隆抗體23C3。小鼠同種異基因皮膚移植術(shù)當(dāng)天為第0天。
　　 d)組織切片:在皮膚移植術(shù)后的第8天進(jìn)行組織切片,觀察炎癥浸潤情況。
　　 3.凋亡細(xì)胞的制備
　　 4周齡SPF級(jí)Balb/c小鼠,處死后迅速取胸腺研磨,PBS洗滌兩次,最終制備

12、成細(xì)胞濃度為1×106/ml的單個(gè)細(xì)胞懸液。用地塞米松20μM誘導(dǎo)6小時(shí)。使用Annexin Ⅴ-FITC和PI染色,流式細(xì)胞儀檢測來判斷凋亡率。
　　 4.利用OPN敲除聯(lián)合供者凋亡細(xì)胞靜脈輸注,進(jìn)一步研究OPN對(duì)小鼠皮膚移植排斥反應(yīng)的影響
　　 a)動(dòng)物分組:受者小鼠,按照體重、年齡、性別相同的情況,分為四組:野生型C57BL/6小鼠對(duì)照組,6只小鼠； OPN敲除小鼠組,6只小鼠；靜脈輸注供者凋亡細(xì)胞組,6只小鼠；O

13、PN敲除小鼠聯(lián)合靜脈注射供者凋亡細(xì)胞組,6只小鼠。
　　 b)凋亡細(xì)胞靜脈注射:后兩組小鼠均尾靜脈注射1×108個(gè)供者胸腺細(xì)胞來源的凋亡細(xì)胞。
　　 c)皮膚移植:靜脈注射凋亡細(xì)胞后的第8天進(jìn)行小鼠同種異基因皮膚移植術(shù)。受者為C57BL/6品系小鼠,供者均為性別和年齡相配的Balb/c品系小鼠。取供者小鼠的尾部皮膚,移植至受者小鼠的側(cè)部。四角縫合、固定包扎。皮膚移植后第7天拆除繃帶逐日觀察皮膚移植皮片存活情況。
　

14、　 d)組織切片:在皮膚移植后的第8天進(jìn)行組織切片,觀察炎癥浸潤情況。
　　 5.皮膚移植完全排斥表現(xiàn):移植皮片發(fā)黑、發(fā)干、結(jié)痂和皺縮等為移植皮片發(fā)生排斥反應(yīng)的表現(xiàn)。判定小鼠皮膚同種異基因排斥反應(yīng)通常以移植皮片存活面積,或者壞死面積占移植皮片總面積的百分比來定義移植皮片存活還是完全壞死。當(dāng)小鼠移植皮片有發(fā)生排斥反應(yīng)的表現(xiàn),而且排斥面積占小鼠移植皮片總面積的百分比>80％,視為完全排斥。
　　 結(jié)論
　　 1.在

15、小鼠自體皮膚移植方法中,尾部皮膚移植至側(cè)部移植床的移植術(shù)式最利于操作,生存率較高。
　　 2.利用腹腔注射抗OPN的單抗23C3后,不能明顯減輕小鼠同種異基因皮膚移植排斥反應(yīng)。
　　 3.OPN敲除不能明顯減輕小鼠同種異基因皮膚移植排斥反應(yīng)；凋亡細(xì)胞輸注聯(lián)合OPN敲除不能使小鼠同種異基因皮膚移植皮片存活時(shí)間延長；靜脈輸注凋亡細(xì)胞可能延長小鼠同種異基因皮膚移植物生存時(shí)間。
　　 綜上,在小鼠同種異基因皮膚移植排斥反