有機(jī)磷農(nóng)藥敵敵畏和亞胺硫磷免疫檢測(cè)方法的研究.pdf

1、有機(jī)磷農(nóng)藥是目前我國(guó)使用最多的農(nóng)藥，其中敵敵畏（dichlorvos，DDVP）和亞胺硫磷（phosmet，PMP）都是有機(jī)磷農(nóng)藥中最常用的品種。
　　 由于DDVP和PMP使用廣泛，要保證所有食品完全不含其殘留是不可能的。世界上幾乎所有國(guó)家都制定了食品和飼料中DDVP和PMP的最大允許含量并作為強(qiáng)制性限量標(biāo)準(zhǔn)。目前，檢測(cè)DDVP和PMP的方法主要有氣相色譜法和酶抑制法，但是前者的樣品前處理過(guò)程復(fù)雜并需要昂貴的儀器設(shè)備，而后者的

2、假陽(yáng)性較高。為此，免疫學(xué)方法因其具有快速、準(zhǔn)確、靈敏、操作簡(jiǎn)單、成本低等優(yōu)點(diǎn)而成為檢測(cè)DDVP和PMP等有機(jī)磷農(nóng)藥的研究熱點(diǎn)。
　　 本課題從抗原的構(gòu)建著手，首先采用Mannich法將DDVP、PMP與陽(yáng)離子化牛血清白蛋白（cationized bovine serum albumin，cBSA）偶聯(lián)，構(gòu)建了完全抗原DDVP-cBSA和PMP-cBSA，然后利用紫外和紅外光譜分析方法對(duì)它們進(jìn)行了分析。在此基礎(chǔ)上，分別以DDVP-

3、cBSA和PMP-cBSA免疫BALB/c小鼠，分析了兩種抗體的產(chǎn)生進(jìn)程、效價(jià)和靈敏度。同時(shí)以DDVP-cBSA為免疫抗原，采用細(xì)胞雜交瘤技術(shù)，獲得了能穩(wěn)定分泌抗DDVP單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞，并對(duì)單克隆抗體的效價(jià)和靈敏度進(jìn)行了分析。
　　 1．完全抗原的構(gòu)建及其光譜學(xué)分析
　　 DDVP和PMP的分子量分別為190和317，是只有反應(yīng)原性而無(wú)免疫原性的半抗原（hapten），只有通過(guò)與載體蛋白偶聯(lián)，才能刺激機(jī)體產(chǎn)生抗體

4、。
　　 本研究首先制備了cBSA，然后采用Mannich法，使其與DDVP和PMP偶聯(lián)，得到摩爾比分別為40：1和1.5：1的DDVP-cBSA與PMP-cBSA。
　　 再利用UV-Vis和FT-IR光譜分析方法，對(duì)cBSA、DDVP-cBSA和PMP-cBSA進(jìn)行分析。結(jié)果表明，cBSA的UV-Vis最大吸收峰有微弱藍(lán)移，而DDVP-cBSA在278 nm處有蛋白質(zhì)的吸收峰，其雜質(zhì)峰掩蓋了DDVP的特征吸收峰；PM

5、P-cBSA在278 am處的吸收峰，迭加了PMP的特征吸收峰。在FT-IR．中，DDVP與cBSA偶聯(lián)后，在1286～1258 cm-1處和1050～950 cm-1出現(xiàn)了DDVP弱峰以及蛋白質(zhì)1650 cm-1處的強(qiáng)峰；PMP與cBSA偶聯(lián)后，在833～790 cm-1處和663～645 cm-1處出現(xiàn)了PMP弱峰和蛋白質(zhì)1650 cm-1處的強(qiáng)峰。
　　 上述光譜分析結(jié)果表明，DDVP和PMP與cBSA偶聯(lián)成功。
　

6、　 2．抗DDVP和PMP多克隆抗體的制備及其性質(zhì)研究
　　 以DDVP-cBSA和PMP-cBSA分別免疫BALB/c小鼠，免疫間隔為15 d，免疫3～4次后，均能有效地產(chǎn)生抗體。其中，抗DDVP抗血清效價(jià)在免疫7次后最高達(dá)1.6×104，而抗PMP抗血清效價(jià)在免疫6次后最高達(dá)1.2×104。間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA分析表明，兩種抗血清的靈敏度分別達(dá)到473 ng/mL和482 ng/mL。
　　 3．抗DDVP單克隆抗體