十字孢堿產(chǎn)生菌優(yōu)化及其衍生物合成研究.pdf

1、吲哚咔唑類生物堿由于其獨(dú)特的結(jié)構(gòu)和良好的生物活性引起了許多有機(jī)化學(xué)家和藥物學(xué)家濃厚的興趣和熱切的關(guān)注,其中以十字孢堿(staurosporine,ST)為代表的衍生物更是由于其強(qiáng)的蛋白激酶C(PKC)抑制活性吸引了眾多研究者的目光。本文從十字孢堿的產(chǎn)生菌株出發(fā),開(kāi)展了一系列的研究工作。研究?jī)?nèi)容主要有:十字孢堿產(chǎn)生菌的優(yōu)化——產(chǎn)生菌的篩選,高產(chǎn)菌株的選育,代謝調(diào)控研究,混合培養(yǎng)對(duì)次生代謝產(chǎn)物的影響以及突變高產(chǎn)株十字孢堿類似物的研究;另外,

2、對(duì)高產(chǎn)菌株規(guī)模發(fā)酵,建立了十字孢堿的提取純化方法,并對(duì)獲得的十字孢堿進(jìn)行了衍生物合成工作,尋找新的活性高、毒副作用小的蛋白激酶C抑制劑。
　　 實(shí)驗(yàn)室保藏的放線菌株分別來(lái)自青島膠州灣的海泥、青島東風(fēng)鹽場(chǎng)的鹽池底泥,從中進(jìn)行廣泛的篩選,獲得了3株產(chǎn)生十字孢堿的鏈霉菌,分別是S.fradiae007、S.arenae Z4007、S.rubrolavendulae THW-12。對(duì)這3株的十字孢堿的產(chǎn)量進(jìn)行定量分析,發(fā)現(xiàn)產(chǎn)量較低,均

3、在1μg/ml左右。因此開(kāi)展了高產(chǎn)菌株的選育工作,采用常規(guī)的理化因子誘變,通過(guò)簡(jiǎn)便有效的紫外和亞硝基胍進(jìn)行復(fù)合誘變,從菌株S.fradiae007中得到3株高產(chǎn)突變株:S.fradiae M297、S.fradiae M301、S.fradiae M315,其中S.fradiae M315發(fā)酵效價(jià)由原來(lái)的1.02μg·mL-1提高到9.06μg·mL-1,提高了8倍,突變株經(jīng)過(guò)穩(wěn)定性試驗(yàn)考察,性能穩(wěn)定。
　　 為了提高菌株的發(fā)酵

4、效價(jià),還開(kāi)展了代謝調(diào)控和混合培養(yǎng)研究。期望通過(guò)添加代謝前體、酶抑制劑以及競(jìng)爭(zhēng)性生長(zhǎng)因子等誘發(fā)新的次生代謝途徑。初步研究了五種常見(jiàn)甲基酶抑制劑對(duì)十字孢堿產(chǎn)生菌的影響,包括D-甲硫氨酸、D,L-乙硫氨酸、S-腺苷-L-高半胱氨酸、西奈芬凈;發(fā)現(xiàn)在培養(yǎng)時(shí)加入甲基化酶抑制西奈芬凈,可使THW-12產(chǎn)生去甲基十字孢堿,但是產(chǎn)量較低。通過(guò)桐花樹(shù)根部的內(nèi)生真菌Penicillium citrinum WC29-5與鏈酶菌S.Fradiae007的混合

5、培養(yǎng),考察了混合培養(yǎng)對(duì)次生代謝產(chǎn)物的影響,獲得了10個(gè)化合物(1-10),首次確定了化合物6的絕對(duì)構(gòu)型;細(xì)胞毒活性評(píng)價(jià)表明,化合物6對(duì)A549及HL-60細(xì)胞IC50值分別是0.9、0.8μM?；旌吓囵B(yǎng)的次級(jí)代謝產(chǎn)物與純培養(yǎng)發(fā)生了很大的變化,雖然沒(méi)有提高十字孢堿的產(chǎn)量,但是生成了不同于純培養(yǎng)的活性次生代謝產(chǎn)物,為以后進(jìn)一步研究混合培養(yǎng)積累了經(jīng)驗(yàn)。
　　 突變株M315經(jīng)過(guò)發(fā)酵條件優(yōu)化,進(jìn)行大發(fā)酵(250L)。對(duì)其發(fā)酵產(chǎn)物進(jìn)行追蹤

6、分離,建立了十字孢堿(19)的提取純化方法,同時(shí)還獲得了9個(gè)其它吲哚咔唑類生物堿,其中化合物(11-13)為新化合物,其結(jié)構(gòu)特點(diǎn)是在十字孢堿的4'N上出現(xiàn)了取代基,化合物11出現(xiàn)了氰基,而12和13則分別在該位置出現(xiàn)了另一分子的色氨酸片段和雜原子基團(tuán)。
　　 以十字孢堿為原料,以得到PKC412和UCN-01(正在進(jìn)行臨床試驗(yàn)研究)的鹵代產(chǎn)物為目標(biāo),對(duì)7-位亞甲基、4'N以及芳環(huán)進(jìn)行結(jié)構(gòu)修飾,研究鹵代化合物對(duì)該類化合物的影響,期

7、望得到“me-too”或者“me-better”藥物分子。目前已經(jīng)合成了50個(gè)化合物,其中新化合物45個(gè),以A549及HL-60腫瘤細(xì)胞株為模型,用SRB法或MTT法對(duì)得到的進(jìn)行了化合物抗腫瘤活性評(píng)價(jià),其中化合物116,117,123,194,207,222顯示了良好的細(xì)胞毒活性,對(duì)A549腫瘤細(xì)胞株IC50值分別為0.8、0.5、5.1、1.0、0.6、0.4μM,對(duì)HL-60腫瘤細(xì)胞株IC50值分別為1.1、1.4、4.9、1.1、

8、0.9、0.9μM;分子水平的活性評(píng)價(jià)表明,化合物123,124,126,204對(duì)PKCβ2具有很強(qiáng)的抑制活性,其IC50值分別為22.3,14.4,37.0,24.5nM。
　　 綜上,對(duì)十字孢堿為研究對(duì)象,篩選獲得子3株產(chǎn)生菌株:通過(guò)復(fù)合誘變獲得了高產(chǎn)菌株,考察了代謝前體、甲基化酶抑制劑以及微生物種間競(jìng)爭(zhēng)性生長(zhǎng)對(duì)次生代謝產(chǎn)物的影響,得到了10個(gè)混合培養(yǎng)的次級(jí)代謝產(chǎn)物,其中一個(gè)具有良好的細(xì)胞毒活性;通過(guò)突變株的規(guī)?；l(fā)酵,獲得