酶促細(xì)菌生物發(fā)光體系的建立及其在細(xì)菌總數(shù)檢測(cè)方面的應(yīng)用.pdf

1、細(xì)菌總數(shù)是食品質(zhì)量控制的重要指標(biāo),對(duì)食品及其加工環(huán)境的監(jiān)測(cè)有重要的意義,在食品衛(wèi)生安全以及疾病防控中扮演著重要的角色。準(zhǔn)確、快速、靈敏的細(xì)菌總數(shù)檢測(cè)技術(shù)的研究與開(kāi)發(fā)是食品安全檢測(cè)研究的熱點(diǎn)方向。
　　細(xì)菌熒光素酶生物發(fā)光體系是基于細(xì)菌胞內(nèi)NADH含量恒定且細(xì)菌數(shù)量與NADH含量有很好的相關(guān)性而建立的,通過(guò)對(duì)NADH的定量檢測(cè)可達(dá)到檢測(cè)細(xì)菌數(shù)量的目的。本實(shí)驗(yàn)室已將該方法應(yīng)用于大腸桿菌、克雷伯氏菌、副溶血弧菌的檢測(cè),但是由于胞內(nèi)NAD

2、H的低水平含量,檢測(cè)限局限于107 cfu/mL左右,不能滿足許多高靈敏檢測(cè)的要求,因而補(bǔ)充適宜的發(fā)光底物,最大限度地提高檢測(cè)靈敏度是亟需解決的問(wèn)題。本論文根據(jù)細(xì)菌熒光素酶生物發(fā)光體系的發(fā)光強(qiáng)度與其必需底物NAD(P)H的良好相關(guān)性,借助外源酶促反應(yīng)將氧化型吡啶核苷酸轉(zhuǎn)化為還原型吡啶核苷酸,提高生物發(fā)光方法檢測(cè)靈敏度,達(dá)到定量檢測(cè)細(xì)菌數(shù)量的目的;此外胞內(nèi)低水平的ATP通過(guò)擴(kuò)增反應(yīng)實(shí)現(xiàn)對(duì)數(shù)增長(zhǎng)并轉(zhuǎn)化為NADH,借助細(xì)菌生物發(fā)光方法達(dá)到定性

3、檢測(cè)細(xì)菌數(shù)量的目的。
　　第一:根據(jù)酶促反應(yīng)可實(shí)現(xiàn)吡啶核苷酸之間相互轉(zhuǎn)化的原理,通過(guò)對(duì)酶促反應(yīng)條件優(yōu)化,建立了乙醇脫氫酶體系、葡萄糖-6-磷酸脫氫酶體系、乳酸脫氫酶體系、谷胱甘肽還原酶體系。四種體系可以實(shí)現(xiàn)NAD+與NADH、NADP+與 NADPH之間最大程度轉(zhuǎn)化,為酶促細(xì)菌生物發(fā)光法應(yīng)用于細(xì)菌總數(shù)的檢測(cè)奠定基礎(chǔ)。
　　第二:應(yīng)用細(xì)菌生物發(fā)光反應(yīng)與NAD(P)+還原反應(yīng)結(jié)合定量檢測(cè)細(xì)菌總數(shù)。根據(jù)胞內(nèi)氧化型吡啶核苷酸(NAD

4、+、NADP+)可以分別通過(guò)乙醇脫氫酶體系、葡萄糖-6-磷酸脫氫酶體系轉(zhuǎn)化成還原型吡啶核苷酸(NADH、NADPH),從而實(shí)現(xiàn)信號(hào)的放大,達(dá)到提高靈敏度的目的。以四種吡啶核苷酸含量為媒介,細(xì)菌生物發(fā)光強(qiáng)度與細(xì)菌總數(shù)呈良好的線性關(guān)系(R2=0.98),檢測(cè)限可達(dá)到1.05×105 cfu/mL,與之前發(fā)光體系相比靈敏度提高100倍。
　　第三:應(yīng)用細(xì)菌生物發(fā)光反應(yīng)與ATP擴(kuò)增反應(yīng)結(jié)合定性檢測(cè)細(xì)菌總數(shù)。胞內(nèi)低濃度的ATP借助擴(kuò)增反應(yīng)可