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文檔簡介
1、惡性腫瘤又稱作癌癥,是當今嚴重威脅人類健康的最主要疾病之一,與心腦血管病、糖尿病并稱為二十一世紀威脅人類健康的三大殺手。近年來癌癥的發(fā)病率越來越高,日常預防、盡早發(fā)現(xiàn)、及時治療是防治癌癥的關鍵。故發(fā)展針對腫瘤細胞和腫瘤組織的癌癥早期檢測方法一直是醫(yī)學、生物學等相關學科和領域廣泛關注的研究重點和難點之一。誕生于上世紀80年代末的納米技術已經(jīng)引起了許多領域的變革,并以其獨特的性能,在化學、生物、醫(yī)學等諸多領域得以應用,為生物分子相互作用的機
2、理研究、人類疾病機理研究、腫瘤的早期診斷及治療等提供了新的技術和方法。其中,將基于納米材料的生物傳感器用于腫瘤的早期檢測正是當前研究人員關注的熱點之一。
金納米粒子具有良好的生物相容性,通過對其表面進行功能化,可形成具有特殊功能的金納米粒子探針分子。另外,金納米粒子在紫外-可見區(qū)出現(xiàn)的表面等離子體共振吸收峰隨金納米粒子形狀、粒子間距離、溶液介電常數(shù)及溫度等因素的變化而變化,進而導致納米金膠溶液的顏色變化。目前基于金納米粒子這種
3、性質(zhì)的比色法已廣泛應用于生物分子的檢測。氧化石墨烯(GO)是一種由平面單層碳原子緊密堆積而成的二維蜂窩狀晶體,其表面帶有大量含氧功能團,水溶性良好。另外GO的生物相容性非常好,同時GO具有獨特的電子結(jié)構(gòu)性能,是一種高效的、普適性的熒光淬滅材料。利用GO優(yōu)良的熒光淬滅性能構(gòu)建的熒光共振能量轉(zhuǎn)移(FRET)型生物傳感器已廣泛用于檢測各種生物分子。
基于此,本論文構(gòu)建了兩種基于納米材料的生物傳感器。一種是核酸適體型納米金生物傳感器,
4、我們將該傳感器與特異性識別T-cell人急性白血病細胞的發(fā)卡型核酸適體相結(jié)合,在循環(huán)酶切信號放大策略的輔助下,首次構(gòu)建了細胞誘導的循環(huán)酶切信號放大比色法,并將其用于腫瘤細胞的可視化、高靈敏檢測。另一種是多肽-氧化石墨烯FRET型生物傳感器,該傳感器可實現(xiàn)腫瘤細胞中早期腫瘤預警指標Cyclin A2蛋白的可視化檢測。論文主要內(nèi)容如下:
第一章緒論
首先,介紹了腫瘤的研究背景和腫瘤的診斷方法;其次,系統(tǒng)闡述了基于納米材料
5、的生物傳感器在生物分析中的應用,并著重闡述了金納米粒子和氧化石墨烯的制備、生物功能化、性質(zhì)及其在生物分析中的應用;最后,提出了本論文的研究目的和研究意義。
第二章基于細胞誘導的循環(huán)酶切信號放大比色法檢測腫瘤細胞的研究
在本章工作中,我們構(gòu)建了細胞誘導的循環(huán)酶切信號放大比色法,并將其應用于腫瘤細胞的檢測。首先,采用一步還原法合成了13 nm金粒子,并采用配體交換法將巰基DNA修飾到金納米粒子表面;其次,設計能特異性識別
6、T-cell人急性白血病細胞(CCRF-CEM)的發(fā)卡型核酸適體。當目標細胞不存在時,發(fā)卡型核酸適體和連接DNA可穩(wěn)定共存于溶液中,加入兩種巰基DNA修飾的金納米粒子后,連接DNA可使兩種金納米粒子發(fā)生團聚,溶液顏色由紅變紫變化;當目標細胞存在時,發(fā)卡型核酸適體構(gòu)型發(fā)生變化,并與連接DNA雜交,形成核酸內(nèi)切酶的識別位點,連接DNA被酶切為兩段碎片后與核酸適體分離,后者可與新的連接DNA雜交、酶切,從而形成循環(huán)酶切信號放大過程,最終,連接
7、DNA碎片不再使兩種金納米粒子發(fā)生團聚,溶液保持紅色。該方法具有較高的信號放大效率,當CCRF-CEM細胞個數(shù)在100至10000范圍內(nèi),可得到良好的線性響應,檢測限可達40個細胞,比未經(jīng)信號放大的比色法低近20倍。該方法簡單、靈敏,可用于腫瘤細胞的可視化、高靈敏檢測。
第三章多肽-氧化石墨烯FRET型生物傳感器用于腫瘤細胞中CyclinA2蛋白的可視化檢測
在本章中,我們利用橫向尺寸在納米級的nano-GO熒光淬滅
8、性能好及其吸附多肽探針的性質(zhì),構(gòu)建了一種多肽-氧化石墨烯FRET型生物傳感器,并將其應用于腫瘤細胞中Cyclin A2蛋白的可視化檢測。首先,利用Hummers方法,在超聲輔助下,制備了水溶性良好、橫向尺寸在納米級的nano-GO;其次,通過CCK-8實驗證實了nano-GO良好的生物相容性;最后,利用綠色熒光基團FAM修飾能特異性識別Cyclin A2蛋白的多肽探針p1,該探針可與nano-GO通過π-π作用、靜電作用等形成穩(wěn)定的FA
9、M-p1/nano-GO復合物。p1探針和nano-GO之間發(fā)生FRET,可有效地降低背景熒光信號。當引入目標蛋白時,目標蛋白與多肽探針之間特異性結(jié)合,使p1遠離nano-GO表面,從而使得被淬滅的熒光得到恢復。該方法的靈敏度高、選擇性好,在均相溶液中可得到良好的線性響應,檢測限可達0.16 nM,優(yōu)于Tb3+螯合目標蛋白Cyclin A2的0.6μM的檢測限。將復合物探針分子與腫瘤細胞孵育,當其進入細胞后,細胞內(nèi)的目標蛋白與多肽探針之
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