菠蘿蛋白酶提取、分離純化及穩(wěn)定性研究.pdf

1、本研究測定并比較了菠蘿果、皮、莖中蛋白酶活性及蛋白質(zhì)含量，得到同一品種及成熟度的菠蘿果、莖及皮中的酶活差距較大，菠蘿莖中酶活性最高，果肉中次之，皮中最低。以菠蘿莖為原料，比較了高嶺土吸附法，超濾濃縮有機(jī)溶劑沉淀法及納米二氧化鈦吸附法對(duì)莖菠蘿蛋白酶純化效果的影響。對(duì)納米二氧化鈦吸附法制備的莖菠蘿蛋白酶采用離子交換層析法進(jìn)一步純化，并進(jìn)行穩(wěn)定性研究。主要結(jié)果和結(jié)論如下： 1.不同方法純化效果比較高嶺土吸附法所得菠蘿蛋白酶回收率為64

2、.3％，純化倍數(shù)2.63倍；超濾濃縮有機(jī)溶劑沉淀法所得酶回收率78.4％，純化倍數(shù)1.34倍：納米二氧化鈦吸附法所得酶回收率64.7％，純化倍數(shù)達(dá)5.29倍。通過三種工藝及純化效果比較得：高嶺土吸附法生產(chǎn)工藝和操作較復(fù)雜，原材料消耗多，所需設(shè)備也多，純化倍數(shù)不高；超濾濃縮有機(jī)溶劑沉淀法截留液中與菠蘿蛋白酶分子量相近的雜蛋白無法除去，導(dǎo)致所得酶制品比活力較低。而納米二氧化鈦吸附生產(chǎn)工藝和操作簡單，原材料消耗少，并能減少與菠蘿蛋白酶分子量相

3、近雜蛋白對(duì)后續(xù)超濾步驟的影響，純化效果優(yōu)于前兩種方法。 2.納米二氧化鈦吸附法工藝優(yōu)化在納米二氧化鈦吸附工藝優(yōu)化過程中，以納米二氧化鈦用量，pH，溫度，吸附時(shí)間等為因素，在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上進(jìn)行正交試驗(yàn)，得到納米二氧化鈦的最佳吸附條件為：納米TiO2用量為吸附液的3.5％，吸附液pH為4.7，吸附溫度15℃，吸附時(shí)間25min，酶吸附率達(dá)98.2％。采用pH6.0，0.4mol/L的檸檬酸緩沖液作為洗脫液洗脫30min，酶回收率

4、達(dá)79.3％。對(duì)洗脫液進(jìn)行超濾，利用40KD和20KD的超濾膜兩級(jí)截留超濾可有效的濃縮菠蘿蛋白酶，去除雜蛋白，操作過程中，壓力差保持在2.5×105～3×105 Pa，酶回收率64.7％，純化倍數(shù)5.29倍。 3.離子交換層析進(jìn)一步分離純化用離子交換層析法對(duì)納米二氧化鈦吸附法所得蛋白酶進(jìn)一步純化。采用美國伯樂公司離子交換樹脂158-0030，以pH6.0的0.01mol/L Tris-磷酸鹽溶液為初始緩沖液，以0.1～1.5 m

5、ol/LNaCl溶液進(jìn)行線性洗脫，得到蛋白酶比活力6.4×103 U/mg·Pr,純化倍數(shù)提高到13.73倍。 4.菠蘿蛋白酶穩(wěn)定性研究對(duì)納米二氧化鈦吸附法得菠蘿蛋白酶進(jìn)行保存穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)，結(jié)果表明：菠蘿蛋白酶在pH5.0～6.5時(shí)，酶活力較穩(wěn)定，pH6.0時(shí)酶活力穩(wěn)定性最好；菠蘿蛋白酶在貯存過程中光對(duì)其穩(wěn)定性的影響顯著，室溫貯存10天后，避光條件下酶活力保留率比室內(nèi)自然光照條件下高13.1％；隨著貯存溫度(T)的升高，菠蘿蛋白酶