以HIV-1 gp41為靶點的融合抑制劑活性評價和篩選方法研究.pdf

1、HIV-1融合抑制劑是以HIV-1包膜蛋白為靶點設計的抗HIV-1病毒藥物,通過抑制病毒與人體靶細胞融合來阻止病毒感染。多肽融合抑制劑T20(Fuzeon,Enfuvirtide)是第一個被美國FDA批準上市并應用于臨床的HIV-1融合抑制劑。但由于T20藥代動力學性質不穩(wěn)定,對HIV-1耐藥株產(chǎn)生耐藥性、成本高等缺點,因此尋找藥代動力學性質穩(wěn)定,抗耐藥,成本低的藥物是開發(fā)新的HIV-1融合抑制劑的主要方向。而發(fā)現(xiàn)有潛力的融合抑制劑則需

2、要以準確、穩(wěn)定、可靠的測試方法為支撐。因此,本文以基于熒光素酶報告基因的細胞-細胞融合方法及熒光共振能轉移為基礎的生化檢測方法分別從細胞水平及分子水平對HIV-1融合抑制劑的活性篩選及作用機制進行了研究。
　　細胞-細胞融合測試方法已成為HIV-1融合抑制劑活性評價的重要手段。此方法可較高程度上模擬病毒感染靶細胞的過程,具有安全、可定量檢測的優(yōu)點。本課題組采用TZM-bl細胞和HL2/3細胞兩種貼壁細胞進行細胞-細胞融合測試。通過

3、化學發(fā)光法對細胞融合后產(chǎn)生的熒光素酶進行檢測從而對細胞融合進行定量測定。本文利用此方法對螺旋穩(wěn)定性多肽、FRET工具肽、共價型多肽融合抑制劑及表面活性劑系列HIV-1融合抑制劑進行了活性評價,實驗采用C34和T20進行對照,篩選出數(shù)個具有低納摩爾活性的融合抑制劑。數(shù)據(jù)表明本方法具有可重復性,對融合敏感的特點。此外,本文還對實驗條件進行了優(yōu)化。
　　熒光共振能轉移方法從分子水平進行融合抑制劑的活性篩選及機制研究,該方法具有簡便,重復

4、性好,測定周期短,可高通量篩選等優(yōu)點。相對于細胞-細胞融合測試方法的多靶點檢測,熒光共振能轉移方法以特定靶點為檢測目標,驗證抑制劑的作用靶點從而確定其作用機制。本課題組以含有gp41 NHR口袋形成區(qū)的多肽為靶點,以連有熒光基團與靶點肽匹配的C多肽為探針,加入抑制劑將探針競爭性替換,通過熒光強度變化進行定量檢測。本文應用此方法對以gp41 NHR口袋形成區(qū)為靶點的兩個多肽系列進行了檢測,得到了多肽抑制膜融合的兩種作用機制,即:與gp41