以gp120為靶點的HIV進入抑制劑的合成及篩選研究.pdf

1、研究背景和目的:
　　 艾滋病(Acquired immunodeficiency syndrome，AIDS)是由人類免疫缺陷病毒(Human immunodeficiency virus，HIV)感染引起的疾病，嚴(yán)重威脅人類的生存，對人口健康和社會經(jīng)濟的發(fā)展產(chǎn)生巨大的影響，全世界估計有3400萬人感染艾滋病。艾滋病病毒的基因組比已知任何一種病毒基因都復(fù)雜，而且變化多樣。到目前為止，依然沒有一種疫苗可以付諸大規(guī)模使用。在今后相

2、當(dāng)長的一段時期內(nèi)，發(fā)展安全有效的抗艾滋病藥物，依然是當(dāng)前艾滋病預(yù)防和治療的重點。
　　 迄今為止已有24種化合物實體和至少9種組合物被批準(zhǔn)用于臨床。可分為逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑、蛋白酶抑制劑、整合酶抑制劑和病毒進入抑制劑四大類。前兩類藥物易誘導(dǎo)HIV耐藥性突變，而且對人體有較大的毒副作用，后兩類僅有3種化合物實體被批準(zhǔn)。
　　 HIV進入抑制劑，盡管目前僅有Enfuvitide(T-20)和Maraviroc兩種，但它們對耐受前

3、兩類抗HIV藥物的病毒依然有效。并且，進入抑制劑是作用在HIV感染的早期階段，能夠阻止HIV與靶細(xì)胞的融合，被認(rèn)為在艾滋病的防治上具有更好的應(yīng)用前景。開發(fā)新的阻止病毒進入的抗HIV藥物也成為目前抗艾滋病藥物研究的熱點。
　　 HIV進入靶細(xì)胞的過程主要由包膜蛋白(Envelope Proteins，Env)介導(dǎo)。在HIV進入靶細(xì)胞過程中，首先是gp120與靶細(xì)胞上的CD4分子和輔助受體（趨化因子受體CCR5或CXCR4等）先后結(jié)

4、合，隨后跨膜亞基gp41的構(gòu)型發(fā)生改變，介導(dǎo)病毒包膜與靶細(xì)胞膜的融合，完成病毒進入宿主細(xì)胞的感染過程。從病毒融合機制的角度，HIV進入抑制劑可分為三大類，一是干擾gp120與CD4受體結(jié)合;二是拮抗輔助受體，阻止其與gp120-CD4復(fù)合物結(jié)合;第三類是阻止gp41核心結(jié)構(gòu)的形成，稱為HIV融合抑制劑。目前，針對HIV進入抑制劑的研究主要集中在兩個方面:一是針對gp120為作用靶點，因為HIV gp120與靶細(xì)胞上的CD4受體相結(jié)合是病

5、毒進入靶細(xì)胞的第一步，如果能在病毒感染的第一步就進行抑制，理論上則可對人體的危害性降到最低，有更好的應(yīng)用前景;二是針對gp41六螺旋束核心骨架的形成進行抑制。
　　 作用于HIV gp120的進入抑制劑主要為大分子的抑制劑和小分子的抑制劑兩大類。其中，大分子抑制劑主要為可溶性CD4及其衍生物以及靶向gp120的廣譜中和抗體兩大類;小分子的抑制劑主要以抑制gp120與CD4結(jié)合為靶點，或者以Phe43結(jié)合空腔為靶點。其化學(xué)結(jié)構(gòu)主要

6、為BMS-378806、BMS-488043和NBD-556、NBD-557及其類似物。
　　 Zhou T等人從HIV感染者的血清中分離出兩個抗體，VRC01和VRC02，它們能夠抑制200多各種亞型HIV毒株中的90％，這是迄今為止分離得到的最廣譜、最有效的中和抗體。通過VRC01-gp120共結(jié)晶的單晶X-射線衍射結(jié)構(gòu)分析，VRC01的結(jié)構(gòu)與CD4有一定的相似性，能部分地模擬CD4與gp120的結(jié)合。與CD4不同的是，VR

7、C01在CD4與gp120結(jié)合方向上偏轉(zhuǎn)了43°，并且離開了6(A)的距離。這使得VRC01既能結(jié)合于gp120上易受攻擊的CD4作用位點，又能克服gp120表面糖基及構(gòu)象的掩蓋作用。VRC01上CDR H2的Arg61能插入到gp120上V5與β24圍成的空腔中，并形成5個氫鍵的作用。Arg61結(jié)合靶穴可能是中和抗體具有廣譜、高效活性的重要作用靶點。如果化合物能結(jié)合在這一結(jié)合靶點，則可能具有較好地抗HIV感染的活性。這項研究為抑制HI

8、V的感染找到了座標(biāo)，使得研制艾滋病疫苗的目標(biāo)更加明確;同時，也為設(shè)計作用于gp120的小分子化合物找到了新的作用靶點，目前還未見報道作用于此靶點的小分子化合物。
　　 小分子進入抑制劑研究方面:BMS-378806與BMS-488043結(jié)合在gp120上的CD4結(jié)合位點，從而阻止gp120與CD4的結(jié)合，其IC50為5 nmol/L。BMS-378806進入了Ⅰ期臨床試驗研究，但因其抗病毒譜太窄被中止了進一步的臨床研究。BMS-

9、488043進入了Ⅱ期臨床研究，但因為劑量相對太大(1800 mg)而被暫停。針對BMS-378806所做的類似物的結(jié)構(gòu)改造工作并沒有取得很大的突破，目前還沒有藥物上市。NBD-556、NBD-557是本課題組大規(guī)模篩選33000個化合物的基礎(chǔ)上得到的兩個小分子化合物，化學(xué)結(jié)構(gòu)為N-苯基-N'-哌啶基草酰胺衍生物。作用機制研究表明，NBD-556能抑制gp120與CD4的結(jié)合，并且是特異性地作用于gp120，而不是受體CD4分子。NBD

10、-556能起到類似可溶性CD4的作用，結(jié)合到gp120上的CD4 Phe43結(jié)合口袋位置，誘導(dǎo)gp120發(fā)生構(gòu)象變化，使gp120形成輔助受體結(jié)合位點。NBD-556活性在μM級，如何進行結(jié)構(gòu)改造，提高其抗HIV活性，以及對各種亞型HIV病毒株的廣譜抑制活性，是這類小分子化合物研究的關(guān)鍵。
　　 基于以上文獻報道，我們擬從以下兩方面進行研究:
　　 一、基于Arg61結(jié)合靶穴的化合物庫虛擬篩選，并對虛擬篩選打分較高的化合

11、物進行病毒活性測試。對活性化合物進行作用機制研究，并對活性化合物進行結(jié)構(gòu)修飾，以期得到活性更好的化合物。
　　 二、基于Phe43結(jié)合靶穴的化合物結(jié)構(gòu)改造及活性篩選。主要是以NBD-556為先導(dǎo)物，對其進行結(jié)構(gòu)分析，并設(shè)計合成系列類似物，對合成的類似物進行抗HIV活性測試。總結(jié)其構(gòu)效關(guān)系，以期發(fā)現(xiàn)廣譜、高效的小分子化合物。
　　 方法:
　　 對文獻報道的gp120-VRC01復(fù)合物的單晶結(jié)構(gòu)進行分析。VRC01

12、的廣譜中和活性與其CDR H2的Arg61能插入到gp120上V5與β24序列圍成的空腔（Arg61靶穴）有關(guān)，我們首先在曙光W580I桌面超級計算機上，采用分子動力學(xué)模擬，運用MM-PBSA方法計算gp120與Arg61（位點1）以及VRC01的58-61序列（位點2）的結(jié)合自由能。利用分子對接方法，從庫容為40000的IBS天然產(chǎn)物數(shù)據(jù)庫中虛擬篩選能與gp120上的位點1和位點2結(jié)合的化合物，并進一步計算gp120與這些化合物的結(jié)合

13、自由能變化。對結(jié)合自由能降低較大的化合物進行抗HIV假病毒及真病毒的活性篩選，確定先導(dǎo)化合物。最終篩選得到化合物NC-2，并對其抑制病毒感染活性的機制進行研究。同時以NC-2為先導(dǎo)物，對其進行結(jié)構(gòu)修飾，合成系列類似物，并進行活性篩選。
　　 (1)配體數(shù)據(jù)庫:ibs2009oct_nc;受體:3NGB-A;位點1 Ag61，位點258到61號氨基酸序列。
　　 (2)用Surflex-Dock中基于配體的方法生成Prot

14、omol文件，利用分子對接技術(shù)，對ibs2009oct_nc天然產(chǎn)物庫進行虛擬篩選，得到同時與兩個位點結(jié)合打分較高的化合物。
　　 (3)計算打分較高的化合物與gp120結(jié)合的自由能變化情況，使用MM/PBSA的方法進行計算。并與ΔGgp120-VRC01和ΔGgp120-CD4進行比較。
　　 (4)對結(jié)合自由能變化較大的化合物購買，并測試其抗HIV病毒感染的活性，得到小分子NC-2候選化合物。
　　 (5)由

15、于化合物NC-2有較好的抑制HIV假病毒與HIV-1ⅢB實驗株活性，所以對其作用機制進行研究。通過細(xì)胞-細(xì)胞融合實驗，病毒-細(xì)胞融合實驗，時間-過程實驗，判斷NC-2是作用于HIV的進入階段;通過抑制gp120與CD4的結(jié)合實驗，抑制gp41六螺旋束形成實驗，研究其抑制HIV進入的作用靶點。
　　 (6)以NC-2為先導(dǎo)物，進行結(jié)構(gòu)改造，設(shè)計合成系列化合物，并進行化學(xué)合成及抗HIV活性測試。
　　 目前文獻報道的NBD-

16、556類似物的改造，其活性并沒有明顯提高。對NBD-556化學(xué)結(jié)構(gòu)進行分析，2，2，6，6-四甲基-哌啶基及中間的草酰胺連接骨架與其活性密切相關(guān)。因此，我們擬保留四甲基哌啶基，以及中間的草酰胺連接骨架，對其R取代基進行結(jié)構(gòu)修飾，連接不同取代基的芳香環(huán)及雜環(huán)，并對合成的化合物抑制HIV感染的活性進行研究。
　　 (1)以草酰二乙酯或草酰氯單乙酯為原料，通過酯的胺解反應(yīng)及取代反應(yīng)，合成系列NBD-556類似物。
　　 (2)

17、對合成的化合物，進行抗HIV活性測試。
　　 結(jié)果:
　　 以Arg61結(jié)合靶穴為靶點進行虛擬篩選:分別以Arg61，58到61號氨基酸序列作為兩個位點，對庫容為40000的ibs2009oct_nc天然產(chǎn)物數(shù)據(jù)庫進行篩選。先使用Surflex-Dock中基于配體的方法生成Protomol文件，使用12個CPU并行計算，其它參數(shù)使用默認(rèn)值。對接得到位點1得分大于8.0的化合物113個，位點2得分大于8.0的化合物180個

18、，其中有30個化合物既能與gp120上的位點1結(jié)合，也能與位點2結(jié)合，選取這30個化合物，進行結(jié)合自由能的計算。
　　 體系中的結(jié)合自由能的計算采用MM/PBSA與MM/GBSA的方法，分別計算了候選的30個化合物與gp120結(jié)合后的自由能差，并與ΔGgp120-VRC01和ΔGgp120-CD4相比較。gp120與Arg61（位點1）結(jié)合自由能的變化為:PBTOT=-10.67，GBTOT=-13.89。gp120與58-61

19、序列（位點2）的結(jié)合自由能，PBTOT=-18.37，GBTOT=-16.27。其中，gp120與58-61序列的結(jié)合自由能降低值要大于gp120與Arg61結(jié)合自由能的降低值，說明58-61序列與gp120的結(jié)合能力要強于單一的氨基酸殘基Arg61與gp120的結(jié)合能力。gp120與CD4的結(jié)合自由能，PBTOT=-57.95，GBTOT=-23.77。gp120與VRC01的結(jié)合自由能，PBTOT=-113.62，GBTOT=-78

20、.88。通過計算可知，ΔGgp120-VRC01小于ΔGgp120-CD4，說明gp120與抗體VRC01的結(jié)合作用要強于gp120與CD4受體的結(jié)合，這個計算結(jié)果也能說明為什么VRC01結(jié)構(gòu)與CD4類似，卻具有更強效的中和能力，能阻止gp120與CD4結(jié)合。
　　 對侯選化合物與gp120結(jié)合自由能變化較大的19個化合物購買，并用假病毒體系進行抗HIV感染活性篩選。其中NC-2與NC-12有較好的抑制活性，并且這兩個化合物與g

21、p120結(jié)合自由能變化值也較大。NC-2抗HIV-1JRFL假病毒的IC50為10.58μM，抗HIV-1實驗株HIV-1ⅢB的IC50為1.95μM。而且NC-2對靶細(xì)胞的毒性較小，其對U87.CD4.CCR5細(xì)胞的CC50為121.25μM，對MT-2細(xì)胞的CC50為17.23μM。NC-12雖然也具有一定的抗病毒感染的活性，但其抑制病毒感染IC50和對靶細(xì)胞毒性CC50接近，因此NC-12對細(xì)胞毒性較大。其抗病毒活性可能是由于細(xì)胞

22、毒性引起的。
　　 對NC-2抑制HIV感染的作用機制進行研究。NC-2能抑制細(xì)胞-細(xì)胞融合，以及病毒-細(xì)胞融合，時間-過程實驗進一步確認(rèn)NC-2作用于HIV感染的進入階段，且作用于HIV的包膜蛋白（統(tǒng)計學(xué)采用2因素析因分析方法，P＜0.001）。NC-2體外能抗gp120與CD4的結(jié)合，不能抑制gp41六螺旋束的形成（統(tǒng)計學(xué)采用單因素方差分析，多重比較LSD方法，P＜0.001）。說明NC-2可能是通過抑制HIVgp120與C

23、D4的結(jié)合，從而具有抑制HIV感染的作用。
　　 NC-2是天然產(chǎn)物中分離得到的，其來源有限，且活性在μM級。需要對其進行結(jié)構(gòu)優(yōu)化，以期得到活性更好的小分子進入抑制劑。對NC-2化學(xué)結(jié)構(gòu)進行分析，設(shè)計了兩類化合物，并進行化學(xué)合成。其中，合成了2-(3，4，5-三甲氧基)苯甲?；?5-(苯乙炔基)噻吩類似物9個。對其進行抗HIV假病毒活性測試，發(fā)現(xiàn)化合物7b和7c有抑制HIV-1JRFL假病毒感染的活性，其IC50分別為:21.3

24、6±0.78μM和15.14±6.27μM。
　　 以草酸二乙酯或草酰氯單乙酯為原料，通過酯的胺解反應(yīng)及取代反應(yīng)，合成系列NBD-556類似物8個。對其抗HIV活性進行測試，發(fā)現(xiàn)經(jīng)結(jié)構(gòu)改造后的化合物部分具有抗HIV假病毒感染的活性，但與NBD-556相比，活性沒有明顯提高。
　　 結(jié)論:
　　 以Arg61結(jié)合靶穴為靶點，通過計算機虛擬篩選輔助病毒活性測試的方法，得到小分子化合物NC-2具有較好的抗HIV假病毒與

25、HIV-1ⅢB病毒的活性。經(jīng)作用機制研究，發(fā)現(xiàn)NC-2是作用于HIV感染的進入階段，且作用靶點為HIV包膜蛋白。進一步的機制研究表明，NC-2體外能抗gp120與CD4的結(jié)合，不能抑制gp41六螺旋束的形成。這與我們虛擬篩選的目的一致，說明Arg61結(jié)合靶穴是小分子化合物抗HIV感染的一個重要作用靶點。此篩選模型有一定的可信度，有可能用于其它化合物庫的大規(guī)模虛擬篩選。
　　 以NC-2為先導(dǎo)物，進行結(jié)構(gòu)改造，已合成了2-(3，4

26、，5-三甲氧基)苯甲?；?5-(苯乙炔基)噻吩類似物9個?；钚詼y試結(jié)果表明，化合物7b和7c有抑制HIV-1JRFL假病毒感染的活性，其IC50分別為:21.36±0.78μM和15.14±6.27μM。另一個系列的化合物的合成也已取得了突破性的進展。對其進一步的結(jié)構(gòu)優(yōu)化及構(gòu)效關(guān)系研究，有可能得到活性更好的小分子化合物。
　　 以NBD-556為先導(dǎo)物，進行結(jié)構(gòu)優(yōu)化，合成了NBD-556系列類似物8個，抗HIV假病毒感染的活性表