藍(lán)藻NDH-PSI超分子復(fù)合體的鑒定和功能研究.pdf

1、光是光合作用的重要原料，為一切光合生物的生長(zhǎng)提供能量。然而，當(dāng)光超過(guò)植物能承受的范圍時(shí)，則會(huì)起反作用。近年來(lái)，自然環(huán)境的變化和人類活動(dòng)的干擾，產(chǎn)生了高光、高溫、干旱等一系列脅迫，直接或間接地影響著植物的CO2同化作用，導(dǎo)致降低光合作用效率，甚至破壞光合器官。為了減緩環(huán)境脅迫對(duì)光合作用的影響，植物在進(jìn)化過(guò)程中形成了許多重要的適應(yīng)機(jī)制，例如，環(huán)式電子傳遞(CET)。這一機(jī)制能夠通過(guò)形成跨膜質(zhì)子梯度(ΔpH)，產(chǎn)生額外 ATP，從而達(dá)到改善光

2、合作用的目的。
　　藍(lán)藻中，NADPH脫氫酶(NDH-1)介導(dǎo)的CET(NDH-CET)是一種抵抗高光等脅迫的重要機(jī)制。NDH-1復(fù)合體介導(dǎo)了一系列的能化反應(yīng)，包括細(xì)胞呼吸、圍繞系統(tǒng)I(PSI)的CET和CO2吸收。盡管在藍(lán)藻全基因組中不存在與complex I催化活性中心3個(gè)亞基同源的基因，但是從結(jié)構(gòu)上來(lái)看，藍(lán)藻NDH-1復(fù)合體類似于細(xì)菌和線粒體呼吸電子傳遞鏈的能量轉(zhuǎn)換器complex I。最近的研究結(jié)果表明, NdhS亞基的羧

3、基末端與PSI的亞基PsaE存在高度同源，并均包含一個(gè)蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)相互作用的SH3結(jié)構(gòu)域。因此，人們推測(cè)NDH-1可能與PSI存在相互作用。盡管先前的研究結(jié)果支持NADPH是NDH-1的電子供體，但是這一蛋白相互作用為鐵氧化還原蛋白(Fd)給 NDH-1供電子提供了可能。然而到目前為止，人們還沒(méi)有在藍(lán)藻中鑒定到NDH-1與PSI間的相互作用。因此，F(xiàn)d是否是NDH-1復(fù)合體的另一個(gè)電子供體尚不清楚。
　　本論文通過(guò)藍(lán)綠溫和電泳(

4、BN-PAGE)等手段在集胞藻6803(Synechcoystis sp. strain PCC6803)中成功鑒定到分子量大于1,000 kDa的NDH-PSI超分子復(fù)合體，這一發(fā)現(xiàn)為Fd給藍(lán)藻NDH-1供電子提供了生化證據(jù)。主要的研究成果簡(jiǎn)述如下：
　　(1)通過(guò)高光篩選策略，我們從集胞藻6803轉(zhuǎn)座子插入突變體庫(kù)中分離和鑒定到兩個(gè)高光生長(zhǎng)緩慢的突變株。通過(guò) PCR檢測(cè)等，我們發(fā)現(xiàn)兩個(gè)突變株均插入同一個(gè)基因fg1。葉綠素調(diào)制熒

5、光檢測(cè)等結(jié)果顯示，fg1的突變顯著地減弱了NDH-CET的活性。BN-PAGE和蛋白免疫印跡等分析指出，這一突變也影響了NDH-1復(fù)合體的穩(wěn)定性。因此，我們獲得了一個(gè)NDH-CET活性受損的突變體。
　　(2)通過(guò)BN-PAGE等方法分離野生型(WT)和Δfg1中的各種蛋白復(fù)合體，我們?cè)赪T中發(fā)現(xiàn)一條分子量大于1,000 kDa的綠帶(band I)，這一綠帶存在于WT中但缺失在Δfg1中。進(jìn)一步研究表明，band I也缺失在M5

6、5和PSI-less突變株中。這些結(jié)果暗示著band I可能是由Fg1連接NDH-1和PSI形成的NDH-PSI超分子復(fù)合體。為了驗(yàn)證這一假說(shuō)，我們用蛋白免疫印跡和質(zhì)譜等手段分析了band I的各種組分。結(jié)果表明，band I包含了NDH-1，F(xiàn)g1和PSI的所有組分，并且它們可能以1:2:8的化學(xué)計(jì)量存在于這一超分子復(fù)合體中。因此，我們認(rèn)為：fg1的刪除瓦解了這一超分子復(fù)合體，從而導(dǎo)致?lián)p傷了NDH-CET活性。
　　(3)通過(guò)分

7、析一些 NDH-CET活性受影響的突變株(M55，ΔndhD1/ndhD2, M9，ΔndhS，ΔndhO和OX-ndhO)中band I的蛋白豐度，我們發(fā)現(xiàn)band I的蛋白豐度與NDH-CET活性成正相關(guān)。這一發(fā)現(xiàn)暗示著band I的形成可能與NDH-1復(fù)合體的活性相關(guān)。
　　綜上所述，我們首次在藍(lán)藻集胞藻6803中鑒定到一個(gè)分子量大于1,000 kDa的NDH-PSI超分子復(fù)合體，F(xiàn)g1是形成這一超分子復(fù)合體所必需的，并且它