產(chǎn)硫酸軟骨素酶菌株的篩選、發(fā)酵、酶的分離純化及性質(zhì)的研究.pdf

1、硫酸軟骨素酶在研究硫酸軟骨素類糖胺多糖的結(jié)構(gòu)、性質(zhì)與功能等方面有多種重要用途。近年來，該酶在臨床領(lǐng)域的應(yīng)用廣泛，用來治療某些疾病如大骨節(jié)病、椎間盤突出等。同時，該酶在制備低分子量硫酸軟骨素方面也存在著廣闊的應(yīng)用前景。因此，獲得酶活力高的硫酸軟骨素酶具有重要的理論和現(xiàn)實意義。本研究從微生物中篩選出一株高產(chǎn)硫酸軟骨素酶的菌株，并對菌株的發(fā)酵培養(yǎng)條件、酶的分離純化及酶學(xué)性質(zhì)等做了系統(tǒng)的研究。
　　 通過初篩和復(fù)篩從采集的樣品中獲得了一

2、株高產(chǎn)硫酸軟骨素酶菌株，編號為28，對其形態(tài)和生理生化特性進行了測定，初步鑒定該菌株為少動鞘氨醇單胞菌(Sphingomonas paucimobilis)。該菌株所產(chǎn)的硫酸軟骨素酶為胞外酶。
　　 為了提高產(chǎn)酶菌株的產(chǎn)酶能力，采用單次單因素實驗方法對其進行了發(fā)酵產(chǎn)酶條件的優(yōu)化。得到的最適發(fā)酵培養(yǎng)基組成為(％，w/v)：酵母粉1.0+硫酸軟骨素0.5+NaCl0.5+KH2PO40.03+MgSO4·7H2 O0.5，起始pH8

3、.5：最適發(fā)酵培養(yǎng)條件為：搖瓶培養(yǎng)1.0％接種量、250mL搖瓶裝量40mL、25℃、100r/min振蕩培養(yǎng)36h，酶活力可達(dá)1.2U/mL。
　　 硫酸軟骨素酶的分離純化，采用了(NH4)2SO4沉淀、DEAE-Sepharose FastFlow陰離子交換層析及Sephadex G-100凝膠過濾層析等純化步驟，結(jié)果獲得了電泳純的硫酸軟骨素酶，酶純化倍數(shù)為155.62，酶收率為46.87％，比活力為98.04U/mg。經(jīng)S

4、DS-PAGE電泳呈單條帶，分子量約為82.3kDa。
　　 酶學(xué)性質(zhì)的研究包括pH、溫度、金屬離子、底物濃度和底物專一性等。結(jié)果顯示：該酶為誘導(dǎo)酶，在不添加硫酸軟骨素的培養(yǎng)基中沒有酶活性；該酶的最適反應(yīng)pH值為6.5，最適反應(yīng)溫度為40℃；在實驗所涉及的金屬離子中，大部分金屬離子對酶反應(yīng)無影響；該酶對底物具有相對專一性，能降解硫酸軟骨素、透明質(zhì)酸和肝素等這一類結(jié)構(gòu)相似的硫酸軟骨素類糖胺聚糖，而對甲殼素和殼聚糖無降解作用。