TCF4-β-catenin調(diào)控間充質(zhì)干細(xì)胞向HGF的趨化性遷移.pdf

1、組織損傷或神經(jīng)系統(tǒng)疾病嚴(yán)重影響著人類的生命健康和生活質(zhì)量，移植外源性干細(xì)胞修復(fù)受損部位或重塑神經(jīng)組織是目前治療這些疾病的主要策略，但神經(jīng)干細(xì)胞（neural stem cells, NSCs）或胚胎干細(xì)胞（embryonic stem cell, ESCs）由于來(lái)源和倫理等問(wèn)題不能被廣泛應(yīng)用于干細(xì)胞移植。間充質(zhì)干細(xì)胞（mesenchymal stem cells, MSCs）是一類多潛能成體干細(xì)胞，因其具有來(lái)源廣泛、體外增殖快和免疫原性

2、弱等優(yōu)勢(shì)，迅速成為理想的組織工程種子細(xì)胞。體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)證實(shí)MSCs可以沿著趨化因子（HGF、VEGF、SDF）濃度梯度的方向向損傷部位遷移，修復(fù)受損的組織，但是關(guān)于細(xì)胞遷移的具體調(diào)控機(jī)制目前尚不清楚。Wnt/β-catenin信號(hào)通路不僅影響腫瘤的發(fā)生發(fā)展和轉(zhuǎn)移，對(duì)干細(xì)胞的增殖、分化和遷移同樣具有重要的調(diào)控作用。研究發(fā)現(xiàn)許多細(xì)胞因子如HGF、VEGF等可以激活Wnt/β-catenin信號(hào)通路，影響細(xì)胞的分化和遷移，此過(guò)程中沒(méi)有 Wnt蛋

3、白的參與。本文旨在研究肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子（HGF）誘導(dǎo)MSCs趨化性遷移過(guò)程中，Wnt/β-catenin信號(hào)通路的激活情況以及轉(zhuǎn)錄因子TCF4在遷移過(guò)程中的作用，在此基礎(chǔ)上進(jìn)一步揭示與遷移相關(guān)的Wnt靶基因的轉(zhuǎn)錄變化。此外本文還探討了Wnt/β-catenin信號(hào)通路對(duì)MSCs細(xì)胞骨架重排的影響。
　　本研究首先采用Percoll法從SD大鼠的骨髓中成功分離和純化MSCs，并以此細(xì)胞為實(shí)驗(yàn)材料，檢測(cè)HGF對(duì)MSCs中Wnt/β-ca

4、tenin信號(hào)通路的影響。Western blot結(jié)果顯示HGF能夠增加MSCs中β-catenin蛋白的表達(dá)，具有劑量依賴性，50 ng/ml HGF使β-catenin的蛋白表達(dá)水平增加了2倍。接著我們用50 ng/ml HGF處理MSCs不同的時(shí)間，發(fā)現(xiàn)HGF處理30 min，MSCs中β-catenin表達(dá)開(kāi)始增加，具有顯著性差異，一直到240 min MSCs中β-catenin仍處于較高的表達(dá)水平。免疫熒光染色結(jié)果顯示，50

5、 ng/ml HGF處理MSCs30 min，細(xì)胞質(zhì)中β-catenin開(kāi)始累積，并具有向細(xì)胞核轉(zhuǎn)移的趨勢(shì)；處理60 min，β-catenin完全入核；在處理的240 min內(nèi)，β-catenin沒(méi)有明顯出核或降解跡象。此外，通過(guò)TOPFlash/FOPFlash雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)HGF處理MSCs后細(xì)胞中TCF/LEF轉(zhuǎn)錄活性的變化，與對(duì)照組相比，50 ng/ml HGF處理MSCs60 min，細(xì)胞中的TOPFlash報(bào)告基因

6、活性增加了4倍，但FOPFlash報(bào)告基因沒(méi)有明顯的變化。以上這些結(jié)果說(shuō)明50 ng/ml HGF能夠激活MSCs中Wnt/β-catenin信號(hào)通路。
　　本實(shí)驗(yàn)室前期工作發(fā)現(xiàn)，HGF能夠誘導(dǎo)MSCs發(fā)生趨化性遷移，呈現(xiàn)劑量依賴性，50 ng/ml HGF使細(xì)胞的遷移總數(shù)達(dá)到最大值；為了檢測(cè)激活的Wnt/β-catenin信號(hào)通路是否參與MSCs向HGF的趨化性遷移過(guò)程，我們引入Wnt/β-catenin信號(hào)通路的抑制劑FH53

7、5和激活劑LiCl，采用Boyden chamber裝置進(jìn)行細(xì)胞群體性遷移的實(shí)驗(yàn)研究。檢測(cè)結(jié)果發(fā)現(xiàn)抑制劑FH535明顯抑制了MSCs向HGF的遷移，其中5μM FH535使細(xì)胞的遷移總數(shù)下降了30%，20μM FH535使遷移總數(shù)的下降超過(guò)了50%；用LiCl激活Wnt/β-catenin信號(hào)通路則可以進(jìn)一步促進(jìn)MSCs向HGF的趨化性遷移。此外，我們利用Dunn chamber裝置檢測(cè)了FH535和LiCl對(duì)單細(xì)胞遷移軌跡的影響，結(jié)果

8、顯示，相比于對(duì)照組，F(xiàn)H535降低了MSCs向HGF遷移的速度和遷移效率；而LiCl增加了細(xì)胞的遷移速度，對(duì)遷移效率沒(méi)有明顯影響。
　　轉(zhuǎn)錄因子TCF/LEF家族在Wnt/β-catenin信號(hào)通路中起著分子開(kāi)關(guān)的作用，因此接下來(lái)首先檢測(cè)MSCs中TCF/LEF的表達(dá)亞型，結(jié)果顯示雖然MSCs中TCF/LEF四種亞型的轉(zhuǎn)錄因子都有表達(dá)，但是 TCF4的相對(duì)表達(dá)水平遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于其它三種亞型，并且50 ng/ml HGF處理MSCs60

9、min后，TCF4 mRNA和蛋白表達(dá)水平都明顯上升，一直持續(xù)到240 min。免疫熒光染色結(jié)果顯示50 ng/ml HGF處理MSCs60 min能顯著增加TCF4在細(xì)胞核內(nèi)的積累。對(duì)β-catenin和TCF4的共定位染色發(fā)現(xiàn)HGF在促進(jìn)β-catenin聚集到細(xì)胞核的同時(shí)，核內(nèi)的TCF4也明顯增加，兩者呈現(xiàn)共定位關(guān)系。為進(jìn)一步揭示TCF4在MSCs中的功能，我們構(gòu)建了TCF4全長(zhǎng)以及缺失了與β-catenin結(jié)合序列的功能突變型重

10、組腺病毒載體，在QBI-293A中進(jìn)行包裝和擴(kuò)增，并篩選出重組腺病毒感染MSCs的最適病毒復(fù)數(shù)。
　　我們通過(guò)腺病毒載體感染的方法改變MSCs中TCF4的表達(dá)，并利用Boyden chamber和Dunn chamber裝置檢測(cè)腺病毒感染后MSCs向HGF趨化性遷移的變化。與空病毒即只含GFP的對(duì)照組相比，感染Ad-?TCF4后細(xì)胞的群體遷移數(shù)目顯著降低，而感染Ad-TCF4對(duì)MSCs遷移沒(méi)有明顯影響。Dunn chamber統(tǒng)計(jì)

11、結(jié)果顯示，感染Ad-?TCF4組細(xì)胞的遷移速度和遷移效率都顯著降低；而感染Ad-TCF4組對(duì)細(xì)胞的遷移速度和效率沒(méi)有明顯影響。此外，通過(guò)siRNA的方法下調(diào)MSCs中TCF4的表達(dá)也得到了與感染Ad-?TCF4一致的結(jié)果，siRNA下調(diào)TCF4的表達(dá)后，MSCs向HGF遷移的速度和FMI值都顯著下降。接著本文進(jìn)一步研究了Wnt/β-catenin信號(hào)通路影響MSCs遷移的分子機(jī)制。基質(zhì)金屬蛋白酶（MMPs）是一類遷移相關(guān)蛋白，能夠降解細(xì)

12、胞外基質(zhì)，促進(jìn)細(xì)胞的遷移，先前的研究表明很多 MMPs都是Wnt/β-catenin信號(hào)通路的靶基因，在本文中我們檢測(cè)了HGF處理MSCs后MMP2、MMP7和MMP9轉(zhuǎn)錄水平的變化，因?yàn)檫@幾種蛋白在腫瘤的轉(zhuǎn)移中呈現(xiàn)較高的表達(dá)水平。結(jié)果顯示HGF顯著增加了MMP2的轉(zhuǎn)錄水平，對(duì)MMP7和MMP9的轉(zhuǎn)錄沒(méi)有明顯的影響，當(dāng)MSCs感染Ad-?TCF4后，HGF誘導(dǎo)MMP2的轉(zhuǎn)錄增加被抑制了，表明HGF促進(jìn)MMP2的轉(zhuǎn)錄是通過(guò)Wnt/β-ca

13、tenin信號(hào)通路完成的。
　　由于細(xì)胞遷移與細(xì)胞骨架的重排密切相關(guān)，我們最后檢測(cè)了Wnt/β-catenin信號(hào)通路在細(xì)胞骨架重排過(guò)程中的作用。通過(guò)對(duì)F-actin的免疫染色，發(fā)現(xiàn)HGF處理MSCs0.5 min時(shí)細(xì)胞周邊出現(xiàn)肌動(dòng)蛋白聚集形成的片狀偽足，且應(yīng)力纖維沿著極性方向整齊排列，而抑制劑FH535處理使細(xì)胞骨架重排時(shí)間推遲，在0.5 min-2 min之間，細(xì)胞內(nèi)部骨架散亂排布，處理5min后，部分細(xì)胞開(kāi)始出現(xiàn)骨架的重排，

14、說(shuō)明FH535的處理，使MSCs中細(xì)胞骨架重組對(duì)HGF的敏感性下降。
　　綜上所述，Wnt/β-catenin信號(hào)通路參與了MSCs向HGF的趨化性遷移過(guò)程，并通過(guò)其下游靶基因MMP2的轉(zhuǎn)錄促進(jìn)細(xì)胞遷移，其中TCF4是主要的轉(zhuǎn)錄因子，影響細(xì)胞的群體性遷移數(shù)目、遷移速度和遷移效率。本實(shí)驗(yàn)室前期工作發(fā)現(xiàn)HGF激活MSCs中PI3K和MAPKs信號(hào)通路，本實(shí)驗(yàn)研究表明Wnt/β-catenin信號(hào)通路也直接參與了MSCs向HGF的遷移行