2型糖尿病外周血LncRNAs表達(dá)譜改變與胰島功能相關(guān)性的研究.pdf

1、在我國(guó)，2型糖尿病(type2 diabetes mellitus，T2DM)的發(fā)病率呈現(xiàn)出高速發(fā)展趨勢(shì)，據(jù)2013年發(fā)表在JAMA的研究表明，我國(guó)T2DM的患病率已達(dá)到11.6％，總患病人數(shù)達(dá)1.14億，躍居世界第一位，已成為繼腫瘤、心血管病變之后的第三大嚴(yán)重威脅人們健康的慢性病。這與相關(guān)基因表達(dá)異常有關(guān)，而對(duì)于累積的相關(guān)基因表達(dá)異常是否已經(jīng)發(fā)展到“臨界點(diǎn)”，僅憑空腹血糖(fasting plasma glucose，F(xiàn)PG)或者餐后

2、血糖(postprandial plasmaglucose，PPG)等外在表型來(lái)間接判斷并不可、靠，因此深入探索糖尿病易感基因及表達(dá)改變情況，認(rèn)識(shí)其發(fā)病機(jī)理，對(duì)糖尿病的早期診斷和個(gè)體化治療具有重要意義。
　　非編碼RNA(non-coding RNA)近來(lái)成為生命科學(xué)中的研究熱點(diǎn)，被稱為生命體中的“暗物質(zhì)”，廣泛參與人體病理生理活動(dòng)，其調(diào)控失衡可參與眾多疾病的發(fā)生。非編碼RNA是一大類不編碼蛋白質(zhì)，但在細(xì)胞中起著調(diào)控作用的基因分子

3、。大量研究表明，一系列重大疾病的發(fā)生發(fā)展與非編碼RNA的調(diào)控失衡相關(guān)。
　　綜上，本研究擬通過(guò)lncRNA基因芯片構(gòu)建2型糖尿病患者外周血差異表達(dá)的lncRNA表達(dá)譜，篩選和鑒定與T2DM發(fā)生和發(fā)展密切相關(guān)的lncRNA，并通過(guò)生物信息學(xué)分析目的基因的功能。通過(guò)橫斷面研究進(jìn)一步分析2型糖尿病中差異表達(dá)的lncRNA與胰島功能的相關(guān)性，以期為T2DM早期診斷及治療提供新的策略。
　　本課題分以下兩部分:
　　第一章 2型

4、糖尿病差異表達(dá)lncRNAs的鑒定和功能研究
　　目的:
　　通過(guò)lncRNA基因芯片分析2型糖尿病(T2DM)患者和健康對(duì)照組的外周血中差異表達(dá)的長(zhǎng)鏈非編碼RNA(lncRNA)和mRNA。運(yùn)用生物學(xué)功能聚類、KEGG信號(hào)通路分析挑選與2型糖尿病胰島素信號(hào)通路密切相關(guān)的lncRNAs。通過(guò)進(jìn)一步構(gòu)建lncRNA-mRNA調(diào)控網(wǎng)絡(luò)及靶基因預(yù)測(cè)，分析差異表達(dá)的lncRNAs在2型糖尿病發(fā)病過(guò)程中可能參與的調(diào)控機(jī)制。
　　

5、方法:
　　1、收集性別、年齡相匹配的新診斷2型糖尿病患者及健康對(duì)照患者外周血樣本各3例，記錄受試者一般資料，分離提取總RNA。
　　2、采用lncRNAs表達(dá)譜芯片檢測(cè)2型糖尿病患者差異表達(dá)的lncRNAs及mRNA，以差異倍數(shù)（FC值）大于或等于2，且p＜0.05為標(biāo)準(zhǔn)，篩選出2型糖尿病組與健康對(duì)照組比較存在差異表達(dá)的lncRNAs和mRNA。
　　結(jié)果:
　　1、lncRNA芯片結(jié)果分析顯示，2型糖尿病患者

6、組和健康對(duì)照比較存在2270個(gè)顯著差異的lncRNAs，其中1891個(gè)lncRNAs表達(dá)上調(diào)，379個(gè)lncRNAs表達(dá)下調(diào);有2194個(gè)顯著差異的mRNA，其中653個(gè)mRNA表達(dá)下調(diào)，1541個(gè)mRNA表達(dá)下調(diào)。
　　2、對(duì)2型糖尿病患者外周血中差異表達(dá)的基因進(jìn)行生物信息學(xué)分析:GO功能分析表明，差異表達(dá)lncRNA與轉(zhuǎn)錄調(diào)控、RNA代謝過(guò)程調(diào)控、RNA基因沉默、細(xì)胞表面受體信號(hào)轉(zhuǎn)錄、免疫應(yīng)答、防御反應(yīng)、細(xì)胞增殖、細(xì)胞凋亡等功

7、能相關(guān)。KEGG信號(hào)通路分析表明，lncRNA相關(guān)mRNA轉(zhuǎn)錄本的信號(hào)通路主要富集在Jak-STAT信號(hào)通路、胰島素信號(hào)通路、腫瘤相關(guān)信號(hào)通路以及Toll樣受體信號(hào)通路等。(p＜0.01)。從中挑選與胰島素信號(hào)通路相關(guān)，且差異表達(dá)最顯著的前六位基因，分別為lnc-p3134，lnc-p25201，lnc-p34005_v4，lnc-p18324，lnc-p12792，lnc-RNA143599進(jìn)一步分析其表達(dá)水平與2型糖尿病糖脂代謝和胰

8、島功能的相關(guān)性。
　　結(jié)論:
　　2型糖尿病患者外周血中存在差異表達(dá)的長(zhǎng)鏈非編碼RNA，參與轉(zhuǎn)錄調(diào)控、RNA代謝過(guò)程調(diào)控、RNA基因沉默等過(guò)程，主要涉及多種信號(hào)通路調(diào)控，其中1ncRNA-p12792及其靶基因TCF7L2涉及胰島素信號(hào)相關(guān)通路，可能參與調(diào)控T2DM的發(fā)生發(fā)展過(guò)程，提示lncRNA-p12792可能是潛在的2型糖尿病的分子標(biāo)志物。
　　第二章 2型糖尿病相關(guān)lncRNAs與胰島β細(xì)胞功能的相關(guān)性研究

9、r>　　目的:
　　探討6個(gè)糖尿病相關(guān)的lncRNAs(lnc-p3134，lnc-p25201，lnc-p34005_v4，lnc-p18324，lnc-p12792，lnc-RNA143599)在2型糖尿病患者外周血中的表達(dá)情況，及其與糖、脂代謝指標(biāo)及胰島β細(xì)胞功能的相關(guān)性，為T2DM早期診斷及胰島功能評(píng)估尋找新的生物標(biāo)志物。
　　方法:
　　1、收集新診斷2型糖尿病及健康對(duì)照組患者外周血樣本各30例，記錄受試者一

10、般資料，分離提取總RNA。
　　2、采用實(shí)時(shí)熒光PCR驗(yàn)證候選lncRNAs的相對(duì)表達(dá)水平:結(jié)合芯片及生物信息學(xué)分析結(jié)果，選取與胰島素信號(hào)通路相關(guān)的lncRNAs，并從中挑選差異表達(dá)最顯著的前六位基因，采用real-time PCR技術(shù)，驗(yàn)證2型糖尿病組(n=30)及健康對(duì)照組(n=30)外周血差異基因的表達(dá)水平，采用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)比較兩組差異基因的表達(dá)水平。
　　3、檢測(cè)兩組患者的體重指數(shù)(body mass index

11、，BMI)，腰臀比，行口服葡萄糖耐量試驗(yàn)(OGTT)，采用葡萄糖氧化酶法檢測(cè)空腹及75g葡萄糖負(fù)荷后2小時(shí)血糖，采用化學(xué)微粒子免疫法檢測(cè)空腹及餐后2小時(shí)胰島素，采用放射免疫測(cè)定法檢測(cè)空腹及餐后2小時(shí)C肽，采用穩(wěn)態(tài)模型胰島素分泌指數(shù)(HOMA-β)評(píng)估胰島β細(xì)胞胰島素分泌功能，穩(wěn)態(tài)模型胰島素抵抗指數(shù)(HOMA-IR)評(píng)價(jià)胰島素抵抗水平，采用酶聯(lián)免疫吸附法(enzyme-linkedimmunosorbent assay, ELISA)檢測(cè)

12、白介素6（interleukin6，IL-6）、超敏C反應(yīng)蛋白（hyper-sensitive C-reactive protein，hsCRP）的水平，全自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)總膽固醇(TC)、甘油三酯(TG)、高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)及低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)，采用Spearman相關(guān)分析及多元逐步回歸分析差異表達(dá)的lncRNAs與相關(guān)代謝指標(biāo)及胰島功能的相關(guān)性，采用ROC曲線評(píng)估目的基因在2型糖尿病中的診斷價(jià)值。

13、>　　結(jié)果:
　　1、與正常對(duì)照組相比，2型糖尿病患者外周血中l(wèi)nc-p3134，lnc-p25201，lnc-p18324，lnc-p12792，以及l(fā)nc-RNA143599表達(dá)顯著高于正常對(duì)照組，lnc-p34005_v4表達(dá)顯著低于正常對(duì)照組（P均＜0.01），PCR驗(yàn)證結(jié)果與基因芯片結(jié)果一致。
　　2、Spearman相關(guān)分析表明，lnc-p3134與年齡、腰臀比、FBG、空腹C肽、HOMA-IR、TG、LDL-C

14、呈正相關(guān)（p均＜0.05），與HOMA-β呈負(fù)相關(guān)(r=-0.412，p＜0.05)，與BMI、空腹胰島素、TC、HDL-C、IL-6、hsCRP無(wú)相關(guān)性（p均＞0.05）;lnc-p12792與BMI、腰臀比、FBG、TC呈正相關(guān)(p均＜0.05)，與HOMA-β呈負(fù)相關(guān)（r=-0.484，p＜0.05），與年齡、空腹胰島素、空腹C肽、HOMA-IR、TG、LDL-C、HDL-C、IL-6、hsCRP無(wú)相關(guān)性（p均＞0.05）;lnc

15、-RNA143599與年齡、BMI、腰臀比、FBG、空腹C肽、HOMA-IR、TC、TG、LDL-C呈正相關(guān)（p均＜0.05），與HOMA-β（r=-0.398）、HDL-C呈負(fù)相關(guān)（p均＜0.05），與空腹胰島素、IL-6、hsCRP無(wú)相關(guān)性(p均＞0.05);lnc-p25201與腰臀比、FBG、HOMA-IR、TG呈正相關(guān)，與其余指標(biāo)無(wú)相關(guān)性（p均＞0.05）;lnc-p18324與FBG、HOMA-IR、hsCRP、TG呈正相關(guān)

16、（p均＜0.05），與其余指標(biāo)無(wú)相關(guān)性（p均＞0.05）; lnc-p34005_v4與年齡及FBG呈負(fù)相關(guān)（p均＜0.05），與其余指標(biāo)無(wú)相關(guān)性（p均＞0.05）。
　　3、多因素Logistic回歸分析發(fā)現(xiàn)，外周血lnc-p12792表達(dá)水平高的個(gè)體，糖尿病發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)顯著上升，矯正OR值為1.96。多元逐步回歸分析結(jié)果顯示，F(xiàn)BG(β=0.394，p＜0.01)、BMI(β=0.379，p＜0.01)以及HOMA-β(β=-0.

17、391，p＜0.01)是影響外周血lnc-p12792的獨(dú)立因素。通過(guò)對(duì)血糖水平進(jìn)行分層，進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)隨著空腹血糖水平逐漸升高，外周血lnc-p12792的表達(dá)水平也逐漸升高，各組間比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p均＜0.05）。采用ROC曲線評(píng)估lnc-p12792基因在2型糖尿病中的診斷價(jià)值，敏感性為66.7％，特異性為83.3％。
　　結(jié)論:
　　2型糖尿病患者外周血中l(wèi)nc-p3134，lnc-p25201，lnc-p183