大腸桿菌O157-H7和乳源蛋白膠體金免疫層析試紙條的研制.pdf

1、膠體金免疫層析法檢測(cè)乳中大腸桿菌O157:H2和乳源蛋白含量具有快速、靈敏、可用于現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)等優(yōu)點(diǎn),對(duì)乳品的摻假及安全性檢測(cè)具有重要意義,本課題對(duì)檸檬酸鈉還原法、抗壞血酸還原法制備平均粒徑為20nm的膠體金顆粒的條件進(jìn)行了優(yōu)化,并對(duì)兩種方法制得的膠體金進(jìn)行了抗體標(biāo)記比較研究,綜合考慮后得出最佳的膠體金制備條件及方法,接著通過試驗(yàn)確定了試紙條的各固相組成材料,最后研究、制備了大腸桿菌O157:H7和牛乳源蛋白β-酪蛋白膠體金免疫層析試紙條,

2、并對(duì)試紙條的性能進(jìn)行測(cè)定,證實(shí)可用于脫脂乳中大腸桿菌O157:H7和乳源蛋白的檢測(cè)分析。
　　 特異性多克隆抗體的制備:以大腸桿菌O157:H7菌體和牛乳源蛋白β-酪蛋白(β-CN)、α-乳白蛋白(α-LA)為抗原,分別免疫新西蘭大白兔,獲得抗血清,分級(jí)鹽析(50%、40%、33%)粗分離抗血清中抗體,再用蛋白A親和色譜柱對(duì)抗體進(jìn)一步純化,SDS-PAGE檢測(cè)結(jié)果顯示抗體純度達(dá)到90%以上。
　　 膠體金制備方法的確定:

3、采用檸檬酸鈉還原法、抗壞血酸還原法制備平均粒徑為20nm的膠體金顆粒,對(duì)還原劑加入量、加熱時(shí)間進(jìn)行優(yōu)化,得出兩種方法的最佳制備條件為:100m10.01%四氯金酸溶液中,1%檸檬酸鈉的添加量為1.5ml,加熱時(shí)間為10min,1%抗壞血酸添加量為2.0ml,加熱時(shí)間為5min。制備的膠體金顆粒進(jìn)行抗體標(biāo)記比較研究,檸檬酸鈉還原法、抗壞血酸還原法的最佳標(biāo)記pH均是8.0,最佳抗體標(biāo)記量前者(26μl/ml)低于后者(65μl/ml),且E

4、LISA檢測(cè)標(biāo)記抗體活性,后者較高,但由于抗壞血酸溶液易氧化,制備膠體金顆粒重現(xiàn)性不好,影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果,最后選擇檸檬酸鈉還原法為本實(shí)驗(yàn)?zāi)z體金制備最佳方法。
　　 大腸桿菌O157:H7和牛乳源蛋白膠體金免疫層析試紙條的研制:
　　 1)試紙條固相組成材料的確定:以牛β-CN膠體金免疫層析試紙條為代表,對(duì)試紙條固相組成材料進(jìn)行篩選,最后確定Millipore135s、玻璃纖維素膜SB06、聚酯纖維素膜VL98、吸水紙S*27

5、為免疫層析試紙條層析用膜。
　　 2)大腸桿菌O157:H7膠體金免疫層析試紙條的研制:通過實(shí)驗(yàn)確定試紙條上各部分處理如下:免疫膠體金用0.01MpH7.4PBS按1:1倍稀釋后固定于經(jīng)0.01MpH7.4的PBS(含1%BSA、0.1%Tween20)預(yù)處理的玻璃纖維素膜上作為金標(biāo)墊,硝酸纖維素膜上抗O157:H7IgG(T線)、羊抗兔IgG(C線)分別按500μg/ml、100gg/ml的濃度進(jìn)行包被,再用0.01MpH7.

6、4的PBS(含1%BSA)進(jìn)行封閉后用0.01MpH7.4的PBS(含1%BSA、0.1%Tween20)洗滌烘干,硝酸纖維素膜、金標(biāo)墊、樣品墊、吸水紙依次粘貼于PVC底板上組裝成試紙條。其對(duì)大腸桿菌O157:H7純菌液及人工模擬染菌樣品的檢測(cè)靈敏度均為105cfu/ml,可用于實(shí)際樣品檢測(cè),而且特異性、重復(fù)性好,在4℃可放置90天。
　　 3)牛乳源蛋白膠體金免疫層析試紙條的研制:通過實(shí)驗(yàn)確定β-CN膠體金免疫層析試紙條上玻璃

7、纖維素膜經(jīng)預(yù)處理后將免疫膠體金按1:0.5倍稀釋后固定作為金標(biāo)墊,硝酸纖維素膜上抗β-CNIgG(T線)、羊抗兔IgG(C線)均以200μg/ml的濃度進(jìn)行包被,最后組裝成試紙條。對(duì)β-CN標(biāo)準(zhǔn)溶液檢測(cè)靈敏度為31.25μg/ml,對(duì)水稀釋脫脂牛乳檢測(cè)靈敏度為37.5μg/ml,可用于脫脂乳中β-CN含量測(cè)定,檢測(cè)重復(fù)性好,4℃可放置90天,但對(duì)α-CN檢測(cè)呈弱陽(yáng)性。
　　 本課題研制的大腸桿菌O157:H7膠體金免疫層析試紙條