SHH通路對(duì)小鼠內(nèi)毒素性肺損傷及早期臟器發(fā)育作用機(jī)制研究.pdf

1、Sonic Hedgehog(SHH)信號(hào)通路在胚胎發(fā)育和成年組織穩(wěn)態(tài)中起關(guān)鍵作用。經(jīng)典Hh信號(hào)通路是SHH配體與跨膜蛋白受體PTCH(Patched)相結(jié)合，進(jìn)而激活第二個(gè)跨膜蛋白SMO(Smoothened)，活化的SMO導(dǎo)致GLI蛋白穩(wěn)定和核內(nèi)積累。GLI家族包括GLI1(GLI familyzinc finger1)，GLI2(GLI familyzincfinger2)和GLI3(GLI familyzinc finger3)

2、。
　　有充分的證據(jù)表明，SHH信號(hào)通路是胚胎期肺臟形成和發(fā)育過(guò)程中重要的信號(hào)傳導(dǎo)通路，但在出生后的一段時(shí)間和成年動(dòng)物體內(nèi)該信號(hào)通路表達(dá)大為減少。近年來(lái)不少研究表明SHH信號(hào)通路在一些肺部疾病中異常激活，如在肺發(fā)育不良中存在SHH信號(hào)通路的表達(dá)上調(diào)，間質(zhì)性肺疾病中發(fā)現(xiàn)有SHH信號(hào)通路的異常激活，在哮喘和慢性阻塞性肺部疾病中觀察到SHH信號(hào)通路的表達(dá)上調(diào)，在肺小細(xì)胞癌和肺非小細(xì)胞癌中也發(fā)現(xiàn)SHH信號(hào)通路表達(dá)的上調(diào)。但該信號(hào)通路在急性

3、肺損傷的表達(dá)及意義尚不清楚。
　　最新研究表明SHH信號(hào)通路在早期臟器形成和發(fā)育過(guò)程中發(fā)揮重要作用。SHH信號(hào)通路的突變導(dǎo)致脊柱、肛門(mén)、氣管、食管、腎和肢體聯(lián)合綜合征(VACTERL syndrome)。本研究選取腎臟作為代表器官，深入研究SHH信號(hào)在早期臟器發(fā)育中的作用。目前研究表明SHH錯(cuò)義突變和無(wú)效突變與“腎發(fā)育不全”和“泌尿生殖系統(tǒng)畸形”相關(guān)聯(lián)。SHH基因敲除鼠腎發(fā)育不全，表現(xiàn)為輸尿管縮短、腎皮質(zhì)及髓質(zhì)體積減少及腎單位減少

4、。然而SHH調(diào)節(jié)腎臟發(fā)育的具體機(jī)制及其與調(diào)節(jié)腎臟發(fā)育的其他因子之間的相互作用尚不可知。
　　在本研究中，我們分別探討了SHH信號(hào)通路在脂多糖(LPS)致急性肺損傷（acute lung injury，ALI）疾病進(jìn)展過(guò)程中的表達(dá)變化及意義;以及SHH信號(hào)通路在腎臟發(fā)育過(guò)程中的表達(dá)及調(diào)控。
　　第一部分 Sonic hedgehog信號(hào)通路:其對(duì)內(nèi)毒素性肺損傷小鼠模型的保護(hù)作用
　　目的 Sonic hedgehog(S

5、HH)信號(hào)通路在脂多糖(LPS)誘導(dǎo)的小鼠急性肺損傷(ALI)模型中的表達(dá)變化及意義。
　　方法雄性Balb/c小鼠隨機(jī)分為以下4組:對(duì)照組、LPS組、LPS-環(huán)巴胺組和環(huán)巴胺組。急性肺損傷模型是通過(guò)腹腔注射LPS(5mg/kg)建立，LPS-環(huán)巴胺組是在LPS注入30min后給予SHH信號(hào)通路的抑制劑環(huán)巴胺（50mg/kg），通過(guò)HE染色觀察肺組織病理改變，半定量肺組織損傷評(píng)分，測(cè)定肺濕干質(zhì)量比值(W/D)，PCR檢測(cè)肺組織腫瘤

6、壞死因子α（TNF-α）及SHH、Patched(PTC)及下游轉(zhuǎn)錄因子GLI1的mRNA表達(dá)，同時(shí)Western blot檢測(cè)肺組織SHH和GLI1的蛋白表達(dá)情況。
　　結(jié)果 LPS組小鼠的肺組織病理?yè)p傷評(píng)分、肺泡隔厚度、W/D、TNF-α mRNA表達(dá)水平明顯高于正常對(duì)照組(P＜0.05)。LPS組小鼠SHH、PTC、GLI1的mRNA表達(dá)水平在LPS注入后的12h、24h明顯升高，但在6h時(shí)與對(duì)照組無(wú)明顯差異。與對(duì)照組相比，

7、LPS組在6、12、24 h的SHH、GLI1蛋白表達(dá)水平均明顯升高，且與時(shí)間呈正相關(guān)。單獨(dú)環(huán)巴胺組對(duì)正常小鼠肺組織的病理改變無(wú)明顯影響。LPS-環(huán)巴胺組出現(xiàn)SHH、PTC、GLI1的mRNA表達(dá)及SHH、GLI1的蛋白表達(dá)水平降低，同時(shí)，肺組織病理?yè)p傷評(píng)分、肺泡隔厚度、W/D及TNF-α mRNA表達(dá)均高于LPS組。
　　結(jié)論在LPS所致的ALI模型中存在SHH信號(hào)通路的激活，且SHH信號(hào)通路表達(dá)上調(diào)可減輕肺損傷，參與肺組織損傷

8、后修復(fù)。
　　第二部分小鼠體外培養(yǎng)胚腎組織中SHH蛋白表達(dá)及其與Fgf8關(guān)系的研究
　　目的探討Sonic hedgehog(SHH)蛋白在小鼠體外原代培養(yǎng)胚腎組織中的表達(dá)及與成纖維生長(zhǎng)因子8（Fibroblast growth factor, Fgf8）的關(guān)系。
　　方法檢測(cè)胚齡E11.5至E14.5小鼠腎臟組織中SHH及Fgf8表達(dá)水平，體外培養(yǎng)小鼠胚腎組織，分別加入外源性SHH蛋白以及SHH信號(hào)通路抑制劑環(huán)巴胺，

9、分為正常對(duì)照組、SHH組和SHH+環(huán)巴胺組。通過(guò)組織染色和免疫熒光檢測(cè)小鼠原代胚腎組織中輸尿管芽發(fā)育及腎單位數(shù)目以評(píng)估腎臟發(fā)育水平。Real-time PCR法檢測(cè)SHH及FGF8基因在不同階段胚腎組織中的表達(dá)差異。Real-time PCR及Western blot方法分析三個(gè)不同處理組胚腎組織中Fgf8的分布和表達(dá)。
　　結(jié)果在不同的時(shí)間段，小鼠原代胚腎組織中SHH及Fgf8mRNA表達(dá)水平均呈時(shí)間依賴性增高。外源性SHH蛋白