肺上皮細(xì)胞表達(dá)的Sectm1b對(duì)膿毒癥ARDS的影響及作用機(jī)制.pdf

1、膿毒癥（sepsis）是指嚴(yán)重感染導(dǎo)致的全身炎癥反應(yīng)綜合癥(systemic inflammatory response syndrome，SIRS)，宿主針對(duì)感染的特異性免疫反應(yīng)失調(diào)，進(jìn)而可導(dǎo)致膿毒性休克、急性呼吸窘迫綜合征（acute respiratory distress syndrome，ARDS），乃至引發(fā)多器官功能障礙綜合征(multiple organ dysfunction syndrome，MODS)，是ICU患者的

2、主要死亡原因，其發(fā)病率仍然很高。膿毒癥急性呼吸窘迫綜合征的病理生理學(xué)機(jī)制非常復(fù)雜，包括炎癥激活、炎細(xì)胞浸潤(rùn)、凝血系統(tǒng)激活和肺上皮屏障損傷等，其中肺上皮是急性呼吸窘迫綜合征時(shí)肺部防御損傷的一種重要結(jié)構(gòu)。在ARDS的致病過(guò)程中，各種炎癥因子、粘附分子、趨化因子和細(xì)胞因子等不斷釋放參與肺部炎癥反應(yīng)，如腫瘤壞死因子、IL-6、IL-8、IL-1家族和干擾素。肺上皮細(xì)胞能夠分泌多種細(xì)胞因子調(diào)控肺的天然免疫，目前卻沒(méi)有關(guān)于肺上皮細(xì)胞表達(dá)能夠調(diào)控肺部

3、天然免疫的分泌蛋白。因此，對(duì)于肺上皮細(xì)胞在膿毒癥急性呼吸窘迫綜合征的基因表達(dá)及相關(guān)分泌蛋白的機(jī)制探討值得研究，肺上皮細(xì)胞表達(dá)的分泌蛋白有望成為臨床上治療膿毒癥的新的分子靶點(diǎn)。
　　sectm1b基因是一種新型人類編碼基因，其基因表達(dá)的蛋白為sectm1b，即跨膜與分泌蛋白1b，屬于免疫球蛋白超家族。目前sectm1b基因表達(dá)調(diào)控機(jī)制以及效應(yīng)并不清楚，關(guān)于sectm1b的研究也非常少。有研究認(rèn)為：sectm1b可以抑制TCR介導(dǎo)的T

4、細(xì)胞活化從而發(fā)揮促炎的功能。炎癥反應(yīng)的失衡是膿毒癥所致急性呼吸窘迫綜合征的主要原因。右美托咪定作為ICU臨床常用的鎮(zhèn)靜藥物，最近幾年，因?yàn)榘l(fā)現(xiàn)其具有抗炎的作用而逐漸被大家所關(guān)注，但目前沒(méi)有關(guān)于右美托咪定對(duì)膿毒癥ARDS時(shí)sectm1b表達(dá)的影響及抗炎作用的研究。另外，肺上皮細(xì)胞分泌的sectm1b能夠促進(jìn)中性粒細(xì)胞表達(dá)和釋放促炎癥因子，對(duì)中性粒細(xì)胞募集到肺部感染部位具有調(diào)控作用。但是，sectm1b對(duì)膿毒癥ARDS時(shí)肺上皮細(xì)胞功能的作用

5、及其可能的機(jī)制，目前尚未見報(bào)道。
　　本研究擬通過(guò)在體與離體實(shí)驗(yàn)，探討肺上皮細(xì)胞表達(dá)的sectm1b對(duì)膿毒癥ARDS的影響及作用機(jī)制。首先，對(duì)膿毒癥ARDS小鼠肺上皮細(xì)胞高表達(dá)sectm1b的篩選及驗(yàn)證;其次，探討肺上皮細(xì)胞表達(dá)的sectm1b對(duì)膿毒癥ARDS促炎作用及機(jī)制;最后，探討右美托咪定對(duì)膿毒癥ARDS小鼠抗炎作用及其機(jī)制的研究，同時(shí)探討了右美托咪定在膿毒癥ARDS發(fā)揮抗炎保護(hù)作用時(shí)對(duì)肺上皮細(xì)胞sectm1b表達(dá)的影響。<

6、br>　　第一部分 膿毒癥ARDS小鼠肺上皮細(xì)胞高表達(dá)sectm1b的篩選及驗(yàn)證
　　目的：
　　膿毒癥ARDS小鼠肺上皮細(xì)胞高表達(dá)sectm1b的基因芯片篩選與分析，在體實(shí)驗(yàn)和離體實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證膿毒癥ARDS小鼠肺上皮細(xì)胞高表達(dá)sectm1b。
　　方法：
　　1.取雄性C57小鼠，構(gòu)建CLP所致膿毒癥ARDS小鼠模型，分離CLP術(shù)后0h、6h、12h、24h的左肺組織，利用基因表達(dá)譜芯片檢測(cè)CLP術(shù)后不同時(shí)間及正常

7、對(duì)照小鼠肺上皮細(xì)胞基因表達(dá)差異。利用基因表達(dá)熱圖分析、genecard軟件分析及查閱文獻(xiàn)重點(diǎn)分析細(xì)胞因子與趨化因子等分泌性蛋白的表達(dá)。
　　2.取約8周齡雄性C57小鼠，隨機(jī)分為四組，分別為：CLP術(shù)后0h、CLP術(shù)后6h、CLP術(shù)后12h、CLP術(shù)后24h。
　　a.取每組小鼠肺組織，左肺組織行HE染色，并進(jìn)行病理學(xué)評(píng)分;右肺組織提取mRNA，采取RT-PCR技術(shù)檢測(cè)sectm1b mRNA的表達(dá)情況。
　　b.取每

8、組小鼠支氣管肺泡灌洗液，采用ELISA法檢測(cè)炎癥因子IL-6、IL-1β、TNF-α水平及流式細(xì)胞術(shù)進(jìn)行中性粒細(xì)胞計(jì)數(shù)。
　　c.于每組小鼠行眼球取血，離心后取血清，采用ELISA法檢測(cè)IL-6、IL-1β、TNF-α的表達(dá)情況。
　　3.用LPS刺激小鼠肺上皮細(xì)胞MLE12，于LPS誘導(dǎo)后0h、6h、12h、24h提取mRNA，利用RT-PCR檢測(cè)肺上皮細(xì)胞sectm1b mRNA的表達(dá)，同時(shí)收集上清，采用ELISA檢測(cè)上

9、清中IL-6、IL-1β、TNF-α水平。
　　結(jié)果：
　　1.膿毒癥ARDS小鼠肺組織中基因表達(dá)差異顯著，其中sectm1b在CLP術(shù)后12h表達(dá)顯著增高，24h表達(dá)下降。
　　2.
　　a.HE染色結(jié)果顯示：CLP術(shù)后小鼠肺組織病理?yè)p傷明顯加重，且術(shù)后12h損傷程度強(qiáng)于24h，病理學(xué)評(píng)分增高(P＜0.05)。sectm1b mRNA表達(dá)差異顯著（12小時(shí)大于正常約30倍）(P＜0.05)。
　　b.EL

10、ISA結(jié)果顯示：與正常對(duì)照比較，肺泡灌洗液和血清中炎癥因子IL-6、IL-1β、TNF-α水平明顯升高(P＜0.05)。CLP術(shù)后中性粒細(xì)胞計(jì)數(shù)明顯增多（P＜0.05）。
　　3.與正常相比，膿毒癥ARDS小鼠肺上皮細(xì)胞sectm1b表達(dá)增高(P＜0.05)，上清中炎癥因子IL-6、IL-1β、TNF-α水平升高(P＜0.05)。
　　結(jié)論：
　　膿毒癥ARDS小鼠肺上皮細(xì)胞高表達(dá)sectm1b，膿毒癥ARDS小鼠在體

11、實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ团c離體實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ徒⒊晒?，為后續(xù)的在體和離體實(shí)驗(yàn)提供了可靠的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。
　　第二部分 肺上皮細(xì)胞表達(dá)的sectm1b對(duì)膿毒癥ARDS促炎作用及機(jī)制探討
　　目的：
　　研究sectm1b對(duì)LPS誘導(dǎo)的肺上皮細(xì)胞在膿毒癥ARDS炎癥反應(yīng)中的作用及其機(jī)制探討。
　　方法：
　　采用siRNA轉(zhuǎn)染技術(shù)沉默sectm1b基因的表達(dá)，研究在LPS誘導(dǎo)的肺上皮細(xì)胞MLE12在沉默sectm1b時(shí)對(duì)膿毒癥ARDS炎

12、癥反應(yīng)的作用及其機(jī)制。實(shí)驗(yàn)分為:NCsiRNA組和sectm1b siRNA組，轉(zhuǎn)染48小時(shí)后，分別用LPS刺激，提取LPS刺激后不同時(shí)間點(diǎn)的細(xì)胞總mRNA、蛋白、上清。用RT-PCR技術(shù)檢測(cè)sectm1b、IL-6、IL-1β、TNF-α mRNA的表達(dá)，用ELISA技術(shù)檢測(cè)IL-6、IL-1β、TNF-α水平，利用western-blot方法檢測(cè)炎癥相關(guān)信號(hào)通路(NF-κβ/MAPK)相關(guān)分子的表達(dá)。
　　結(jié)果：
　　1

13、.采用siRNA轉(zhuǎn)染MLE12后，LPS誘導(dǎo)12h后，RT-PCR顯示sectm1b siRNA組sectm1b的mRNA表達(dá)水平明顯低于NC-siRNA組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。
　　2.采用siRNA轉(zhuǎn)染MLE12后，LPS誘導(dǎo)6h、12h、24h后，sectm1b siRNA組炎癥因子IL-6、IL-1β、TNF-α mRNA表達(dá)水平較NC siRNA組降低(P＜0.05)，同時(shí)ELISA結(jié)果顯示sectm1b

14、 siRNA組上清中炎癥因子IL-6、IL-1β、TNF-α水平較NCsiRNA組降低（P＜0.05）。
　　3.采用siRNA轉(zhuǎn)染MLE12后，LPS誘導(dǎo)12h后，與NC siRNA組相比，sectm1bsiRNA組的p65/p38/erk磷酸化表達(dá)水平下降(P＜0.05)。
　　結(jié)論：
　　肺上皮細(xì)胞表達(dá)的sectm1b對(duì)膿毒癥ARDS具有促炎作用，其促炎作用可能與NF-κβ/MAPK信號(hào)通路的激活有關(guān)，表明sec

15、tm1b在膿毒癥肺上皮細(xì)胞的損傷具有重要作用。
　　第三部分 右美托咪定對(duì)膿毒癥小鼠肺上皮細(xì)胞sectm1b表達(dá)的影響及保護(hù)作用研究
　　目的：
　　探討右美托咪定(Dexmedetomidine，Dex)在膿毒癥小鼠肺上皮細(xì)胞炎癥反應(yīng)中的作用及其對(duì)sectm1b表達(dá)的影響。
　　方法：
　　將C57小鼠隨機(jī)分為3組:CLP組、CLP+Dex組、Sham組。給藥組在小鼠CLP術(shù)前15min腹腔注射右美托咪定

16、（50ug/Kg），CLP組小鼠在術(shù)前15min腹腔注射等體積的無(wú)菌生理鹽水。收集每組CLP術(shù)后0h，6h，12h，24h的血清和肺泡灌洗液(BALF)，用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)檢測(cè)血清和肺泡灌洗液中IL-6、IL-1β、TNF-α的表達(dá)，記錄24h內(nèi)小鼠的存活率。體外培養(yǎng)傳代小鼠肺上皮細(xì)胞MLE12，分為空白對(duì)照組（未進(jìn)行任何處理）、脂多糖組(LPS，1ug/ml)、脂多糖+右美托咪定組(LPS，1ug/ml+Dex，0.2ug/ml），R

17、T-PCR檢測(cè)總細(xì)胞中sectm1b mRNA的表達(dá)，酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)檢測(cè)上清中IL-6、IL-1β、TNF-α的表達(dá)，蛋白質(zhì)印跡實(shí)驗(yàn)檢測(cè)ERK1/2和JNK磷酸化水平。
　　結(jié)果：
　　1.與CLP組相比，右美托咪定組膿毒癥小鼠血清和肺泡灌洗液中IL-6、IL-1β、TNF-α的表達(dá)下降，小鼠24h內(nèi)的存活率上升(P＜0.05)。
　　2.與脂多糖組相比，右美托咪定組上清中IL-6、IL-1β、TNF-α的表達(dá)減少，

18、并且ERK1/2和JNK的磷酸化水平下降(P＜0.05)。
　　3.與脂多糖組相比，右美托咪定組肺上皮細(xì)胞sectm1b mRNA的表達(dá)下降（P＜0.05）。
　　結(jié)論：
　　右美托咪定能夠影響膿毒癥小鼠肺上皮細(xì)胞sectm1b的表達(dá)，同時(shí)能夠減少膿毒癥小鼠血清和肺泡灌洗液中炎癥因子的產(chǎn)生，提高膿毒癥小鼠24h內(nèi)的存活率，對(duì)小鼠肺上皮細(xì)胞炎癥反應(yīng)發(fā)揮保護(hù)作用，且右美托咪定的這種作用可能與抑制ERK1/2和JNK的激活有