苯基-瓊脂糖疏水層析介質的制備及其對果糖基轉移酶的分離純化.pdf

1、疏水層析是目前生物大分子分離純化中廣泛應用的操作技術。其分離過程具有操作簡便、設備簡單、條件溫和等優(yōu)點。疏水層析介質是該技術的核心要素，制約著疏水層析效果的優(yōu)劣。國內主要使用進口疏水層析介質，價格較高。因此制備低成本，高效率的疏水層析介質也日益被提上日程。本論文以瓊脂糖凝膠Sepharose CL-6B作為基質，對苯基-瓊脂糖（Phenyl-Sepharose CL-6B）疏水層析介質的活化偶聯(lián)以及直接偶聯(lián)制備工藝進行研究。
　　

2、在活化偶聯(lián)法制備Phenyl-Sepharose CL-6B疏水層析介質的實驗中，所得最佳活化條件為：二甲基亞砜（DMSO）28 mL/g，環(huán)氧氯丙烷（ECH）14.4 mL/g，反應溫度35℃，反應時間2.0 h。環(huán)氧基密度最高可達0.881μmol/mg干膠。對活化所得瓊脂糖凝膠進行配基偶聯(lián)工藝探索，所得偶聯(lián)反應的最佳條件為：NaOH19.84 mmol/g，苯酚4mL/g，反應溫度50℃，水浴反應時間為4 h。配基密度最高可達0.

3、707μmol/mg干膠，配基偶聯(lián)率為80.24％。在直接偶聯(lián)法制備 Phenyl-Sepharose CL-6B疏水層析介質的實驗中，最佳反應條件為：苯基縮水甘油醚0.5 mmol/g，三氟化硼乙醚220μL/g，溫度30℃，反應時間50 min。所得配基密度可達1.059μmol/mg干膠。
　　為考察自制疏水層析介質Phenyl-Sepharose CL-6B的化學穩(wěn)定性，分別將兩種途徑制備所得的介質置于蒸餾水、80%乙醇、

4、2 mol/L氯化鈉、6 mol/L尿素和2 mol/L硫酸銨溶液中，經(jīng)過30天后，介質的配基密度雖有下降，但降幅較小，與之前的配基密度基本無異。保存在乙醇、NaCl、尿素和硫酸銨溶液中的介質與保存在水中的介質吸附等溫線無明顯差異，說明自制疏水層析介質 Phenyl-Sepharose CL-6B的化學穩(wěn)定性良好。介質的紅外光譜圖顯示，反應后的介質在1598 cm-1、1495 cm-1以及1497 cm-1處出現(xiàn)苯環(huán)的特征吸收峰，表明

5、Sepharose CL-6B介質已偶聯(lián)上苯基。
　　用自制的疏水層析介質Phenyl-Sepharose CL-6B對果糖基轉移酶粗酶液進行分離純化，以表征該介質的分離性能。首先對發(fā)酵所得的解脂耶羅維亞酵母菌上清液（即粗酶液，活力為2.94 IU/mL，比活力為0.16 IU/μg）進行硫酸銨鹽析，在65%的硫酸銨飽和度下鹽析所得酶活力為76.94 IU/mL，比活力為0.19 IU/μg，活力回收率達95.67%。隨后用自制的

6、疏水層析介質對鹽析所得酶液進行分離，考察了不同 pH，硫酸銨濃度，徑高比，上樣量和流速下，兩種介質對果糖基轉移酶的分離效果，確定了用自制疏水層析介質純化果糖基轉移酶的最適條件。結果表明，在 pH6.5，硫酸銨濃度2.3mol/L，高徑比12，上樣量0.5 mL，流速1 mL/min的情況下，兩種介質均可達到較好的分離效果。最后，用上述條件對果糖基轉移酶進行了分離純化，洗脫峰的活力為6.45 IU/mL，比活力為1.09 IU/μg，其活