巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶Ⅶ在腫瘤細(xì)胞凋亡及轉(zhuǎn)移中的作用.pdf

1、本文選擇與腫瘤轉(zhuǎn)移密切相關(guān)的糖脂和糖蛋白糖鏈(主要在O．糖鏈，也可在N．糖鏈)末端的Lewis抗原的巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶進(jìn)行研究。Lewis抗原有唾液酸化和非唾液酸化兩大類，而αl，3巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶-VII(FUT7)是一種終末糖基轉(zhuǎn)移酶，僅催化唾液酸化的Lewis抗原巖藻糖基化生成SLex，使糖鏈的加工終止，糖鏈的結(jié)構(gòu)不再改變。 細(xì)胞凋亡是多基因嚴(yán)格控制的細(xì)胞程序性死亡過程。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)許多臨床疾病與細(xì)胞凋亡密切相關(guān)，如腫瘤、自身免疫

2、性疾病、神經(jīng)退行性病變等。腫瘤的發(fā)生一方面是由于細(xì)胞周期發(fā)生紊亂，細(xì)胞分裂失控，引起細(xì)胞惡性增殖；另一方面，細(xì)胞凋亡不足也是原因之一。細(xì)胞凋亡異常在大多數(shù)惡性腫瘤的發(fā)病學(xué)上占有重要地位，此外，凋亡調(diào)控機(jī)制失常導(dǎo)致凋亡受阻對于腫瘤轉(zhuǎn)移也是十分重要的。 本文采用質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細(xì)胞的方法在低表達(dá)FUT7的H7721人肝癌細(xì)胞和人肺巨細(xì)胞癌95C細(xì)胞中過表達(dá)FUT7，研究FUT7轉(zhuǎn)染細(xì)胞后能否引起細(xì)胞凋亡以及腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移表型等方面的改變。

3、 全文分下列三個部分： 第一部分FUT7在UVC照射誘導(dǎo)117721人肝癌細(xì)胞凋亡過程中的變化 1．建立UVC照射誘導(dǎo)H7721細(xì)胞凋亡的模型。UVC照射是一種常用的DNA損傷及細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)手段，在本實(shí)驗(yàn)中采用的UVC照射能成功地誘導(dǎo)H7721細(xì)胞凋亡。中劑量(10mJ／cm2)UVC照射H7721細(xì)胞后，繼續(xù)培養(yǎng)12h，可檢測到顯著的細(xì)胞凋亡的發(fā)生，細(xì)胞存活率的降低。 2．UVC照射對H7721細(xì)

4、胞中FUT7mRNA表達(dá)的影響。采用半定量RT-PCR檢測H7721細(xì)胞凋亡過程中FUT7mRNA水平的變化，發(fā)現(xiàn)FUT7mRNA水平在UVC照射后12h及24h顯著上升。 3．UVC照射對H7721細(xì)胞表面SLex表達(dá)的影響。采用流式細(xì)胞儀檢測H7721細(xì)胞凋亡過程中細(xì)胞表面的SLex表達(dá)水平的變化，發(fā)現(xiàn)SLex在UVC照射后12h及24h也有所增加。 以上的這些結(jié)果顯示FUT7在UVC誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡過程中受到相關(guān)

5、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑改變的影響而出現(xiàn)基因表達(dá)增加，本部分雖然沒有檢測可能受影響的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)網(wǎng)絡(luò)，但是有理由推測FUT7對腫瘤細(xì)胞的凋亡有一定的促進(jìn)或抵抗的作用。 第二部分FUT7通過影響MAPK通路調(diào)節(jié)UVC照射誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡 前一部分的結(jié)果顯示UVC照射誘導(dǎo)H7721細(xì)胞凋亡過程中FUT7的mRNA水平及其產(chǎn)物SLex的表達(dá)水平上升，提示FUT7可能參與調(diào)節(jié)UVC照射誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。本部分研究中，我們研究了FUT7過表達(dá)對U

6、VC照射誘導(dǎo)的H7721細(xì)胞凋亡的影響，并初步探討了FUT7發(fā)揮抗凋亡作用的分子機(jī)制。結(jié)果如下：1．成功構(gòu)建了pcDNA3-FUT7質(zhì)粒，轉(zhuǎn)染并篩選獲得穩(wěn)定表達(dá)FUT7的細(xì)胞克隆，RT-PCR、免疫熒光及流式細(xì)胞檢測均證實(shí)過表達(dá)成功。 2．UVC照射誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，無論是DAPI染色還是Caspase3免疫印跡結(jié)果均顯示FUT7過表達(dá)細(xì)胞的凋亡水平低于轉(zhuǎn)染空載體的細(xì)胞，說明FUT7在UVC照射誘導(dǎo)的H772l細(xì)胞凋亡過程中具有抗

7、凋亡作用。 3．UVC照射細(xì)胞后，JNKl／2與p38-MAPK均迅速發(fā)生磷酸化，與轉(zhuǎn)染空載體的細(xì)胞相比，F(xiàn)UT7過表達(dá)細(xì)胞中p38-MAPK磷酸化水平高2至3倍，而JNKl／2的磷酸化水平僅略高一些。盡管正常情況下，F(xiàn)UT7過表達(dá)細(xì)胞中的ERKl／2磷酸化水平高于轉(zhuǎn)染空載體的細(xì)胞，UVC照射后兩株細(xì)胞中ERKl／2磷酸化水平均顯著增強(qiáng)但無差別。 4．采用p38-MAPK特異性抑制劑SB203580預(yù)處理H7721細(xì)

8、胞1小時，前述UVC照射引起的p38-MAPK磷酸化被抑制，同時細(xì)胞的凋亡水平增高。再用SB203580預(yù)處理FUT7過表達(dá)及轉(zhuǎn)染空載體的細(xì)胞，兩株細(xì)胞中UVC照射激活的p38-MAPK磷酸大部分被抑制，同時細(xì)胞凋亡水平增高，并且FUT7過表達(dá)細(xì)胞增加的更多。 以上結(jié)果顯示FUT7在UVC照射誘導(dǎo)H772l細(xì)胞凋亡過程中發(fā)揮抗凋亡作用。ERKl／2，JNKl／2及p38-MAPK信號轉(zhuǎn)導(dǎo)均參與UVC照射誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡，其中以p

9、38-MAPK最有可能涉及FUT7介導(dǎo)的抗凋亡效應(yīng)。因?yàn)橐种苝38-MAPK磷酸化能夠增加細(xì)胞對凋亡的敏感性。與此一致，抑制p38-MAPK磷酸化減少FUT7過表達(dá)細(xì)胞及轉(zhuǎn)染空載體細(xì)胞之間細(xì)胞凋亡程度的差異，說明FUT7至少部分通過增強(qiáng)p38-MAPK信號通路來發(fā)揮其抗凋亡作用。 第三部分FUT7與人肺巨細(xì)胞癌95C細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移的關(guān)系 FUT7可以通過調(diào)節(jié)Selectin等黏附分子來影響細(xì)胞的黏附、遷移等，本部分研究

10、中，我們通過在低轉(zhuǎn)移的人巨細(xì)胞肺癌95C細(xì)胞中瞬時過表達(dá)FUT7，研究FUT7對細(xì)胞體外侵襲能力與黏附能力的影響，并初步探索其發(fā)揮作用的分子機(jī)制。 1．在95C細(xì)胞中瞬時轉(zhuǎn)染過表達(dá)野生型與突變體FUT7，RT-PCR證實(shí)過表達(dá)成功，細(xì)胞免疫熒光證實(shí)野生型FUT7才有強(qiáng)的合成SLex的能力，而突變體FUT7僅有微弱活性。 2．過表達(dá)野生型或突變體FUT7均能增強(qiáng)95C細(xì)胞的體外侵襲能力與對Fibronectin的黏附能

11、力。 3．過表達(dá)野生型或突變體FUT7均能顯著上調(diào)95C細(xì)胞中的Integrin亞基α5和β1的表達(dá)。 實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)FUT7可以提高95C細(xì)胞的體外侵襲能力與對Fibronectin的黏附能力，并且這種作用不依賴于FUT7的巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶活性，而是通過某些未知途徑上調(diào)Integrin亞基α5和βl的表達(dá)來實(shí)現(xiàn)的。 我們的研究首次發(fā)現(xiàn)FUT7涉及UVC照射誘導(dǎo)的H7721細(xì)胞凋亡：1，UVC照射可以上調(diào)FUT