復合誘變和原生質(zhì)體融合選育S-腺苷甲硫氨酸釀酒酵母高產(chǎn)菌株.pdf

1、S-腺苷蛋氨酸(SAM)是細胞內(nèi)重要的生理活性物質(zhì),具有轉(zhuǎn)甲基、轉(zhuǎn)氨丙基、轉(zhuǎn)硫基等生理功能,能夠預防和治療關節(jié)炎、抑郁癥、肝病等疾病,在國內(nèi)外都有很大的市場需求。但是由于菌種問題及技術不成熟,在我國還沒有實現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)。本文利用復合誘變和原生質(zhì)體融合技術選育SAM的釀酒酵母菌株。主要工作如下:
　　 1.比較了凍融法、乙醇提取法和高氯酸法對釀酒酵母細胞破碎提取SAM的不同效果,發(fā)現(xiàn)東融法和乙醇法對SAM的穩(wěn)定性有很大影響,容易造

2、成SAM的損失,不利于SAM的提取。高氯酸法細胞破碎效果最好,釋放的SAM量最多,選為SAM的提取方法。研究并建立了SAM的分析測定方法,選擇精確而高效的HPLC法進行測定,SAM的保留時間在7min左右,每個樣品約10min就可測定完畢。
　　 2.對13個出發(fā)菌株進行了生孢鑒定并測定了它們的生物量和SAM產(chǎn)量,從中選擇出SAM產(chǎn)量高的出發(fā)菌株R1進行單倍體分離,得到60株單倍體。對其中SAM產(chǎn)量較高的單倍體hR10進行UV和

3、DES復合誘變,在含有10μg/mL制霉菌素的平板上進行篩選,最后獲得4株SAM產(chǎn)量有明顯改善的菌株DR1-3、NM14、NM39、NM45,與各自的出發(fā)菌株相比SAM產(chǎn)量分別提高了34.3％、10.9％、14.1％、18.7％。
　　 3.以DR1-3、NM14、NM39、NM45為親本,通過雙親滅活法進行標記,運用PEG誘導親本的融合,在含有20μg/mL制霉菌素的雙層平板上進行篩選,共得到90個融合子,對它們的生物量及SA

4、M產(chǎn)量進行測定,最后篩選到一株SAM產(chǎn)量有明顯提高的融合子F35,其SAM產(chǎn)量為22.5mg/L,與出發(fā)菌株R1相比提高了103％;SAM含量為1.97mg/gDCW,是出發(fā)菌株R1的近2倍,并且遺傳穩(wěn)定性實驗表明其F35的SAM高產(chǎn)性狀穩(wěn)定。
　　 4.優(yōu)化了融合子F35發(fā)酵生產(chǎn)SAM的培養(yǎng)基及發(fā)酵條件。結(jié)果表明,以麥芽糖為碳源、蛋白胨為氮源,pH為6,培養(yǎng)溫度在30℃時有利于F35的生長和SAM的發(fā)酵生產(chǎn)。最后用正交實驗尋求