利用原生質體融合技術進行米曲霉新菌株的選育.pdf

1、米曲霉(Aspergillus oryzae)是釀造業(yè)中的重要微生物，在其生長過程中能分泌多種酶系，其中較重要的是蛋白酶，可將豆類中的蛋白質降解成多肽、氨基酸等可溶性氮物，對醬油、豆瓣、米酒等的產率和風味起著重要作用；然而現(xiàn)在工業(yè)用米曲霉菌株蛋白酶活性高的往往生長速度慢，生長速度快的菌株往往蛋白酶活性低，這就大大降低了生產效率，影響了生產質量。所以目前我國的釀造業(yè)中，米曲霉菌株的選育是個熱點?，F(xiàn)在國內對米曲霉菌株的選育方法主要采用物理和

2、化學的誘變，但是誘變工作量大，隨機性也較大，不易得到理想菌種。針對生產實踐中的這一情況，本試驗通過原生質體融合方法來選育生長速度快且蛋白酶活力高的新菌株。原生質體融合，就是將雙親株的微生物細胞分別通過酶解脫壁，使之形成原生質體，然后在高滲的條件下混合，并加入物理的或者化學的或者生物的助融條件，使雙親株的原生質體間發(fā)生相互凝集，通過細胞質融合，核融合，而后發(fā)生基因組間的交換重組，進而可以在適宜的條件下再生出微生物的細胞壁來，再通過合理的篩

3、選程序，從再生細胞中獲得重組子的過程。 本試驗選取了生長速度快但蛋白酶活性低的米曲霉菌株AS3.951和生長速度慢但蛋白酶活性高的米曲霉菌株CICC2339作為原始親本菌株。首先選用纖維素酶、溶壁酶、蝸牛酶以7：3：1比例混合配成復合酶對其細胞壁進行酶解制備原生質體，其原生質體形成量約為10<'6>個/ml：然后選用紫外、微波及超聲波三種不同的滅活方法進行雙親滅活，探討每種滅活方法的最佳條件，并通過所得融合子的性狀選出最適合米曲

4、霉的滅活方法。結果發(fā)現(xiàn)米曲霉菌株AS3.951采用紫外滅活，米曲霉菌株CICC2339采用超聲波一熱滅活方法，其融合子性狀最好。在選取最佳滅活方法的基礎上，我們采用了原生質體電融合，探討了電融合的最佳條件，即成串脈沖頻率1MHz，成串電壓40V，融合脈沖電壓400V，脈沖寬度80ps，脈沖個數(shù)6個；通過電融合初篩出一批新菌株，并與傳統(tǒng)PEG融合法選育出的菌株進行了性狀上的比較；最后對初篩出來的米曲霉菌株進行傳代實驗，每隔兩代通過福林-酚