水產(chǎn)品中危害物膠體金免疫層析毛細(xì)管檢測技術(shù)的研究.pdf

1、膠體金免疫層析技術(shù)是以膠體金作為示蹤標(biāo)記物，基于抗原抗體特異性結(jié)合的一類快速檢測技術(shù)，具有操作方便、檢測快速、標(biāo)記物穩(wěn)定、成本低、對檢測人員要求不高等優(yōu)點(diǎn)，廣泛應(yīng)用于醫(yī)療診斷、食品安全、環(huán)境監(jiān)測等領(lǐng)域的定性和定量檢測。膠體金免疫層析技術(shù)的載體以硝酸纖維素膜(NC)為主，但由于其生產(chǎn)工藝復(fù)雜很難控制產(chǎn)品的結(jié)構(gòu)差異;膜孔徑、樣品體系、點(diǎn)樣環(huán)境（溫度、濕度）、封閉情況、儲(chǔ)存條件等均對蛋白質(zhì)與膜的結(jié)合產(chǎn)生影響;另外硝酸纖維素膜的材質(zhì)較脆在操作過

2、程中易碎、易折和產(chǎn)生劃痕等，因此檢測過程中易出現(xiàn)拖帶、顯色不均勻的現(xiàn)象致使免疫層析技術(shù)的靈敏度、穩(wěn)定性受到影響，檢測成本降低的空間較小。因此建立一種基底材質(zhì)穩(wěn)定、成本低廉、便于操作的免疫層析快速檢測方法為目前研究的熱點(diǎn)。
　　本文采用廉價(jià)易得、表面均一光滑、透光性好、耐高溫、耐高離子強(qiáng)度清洗的玻璃材質(zhì)作為載體，建立了一種以玻璃毛細(xì)管為基底，以膠體金為標(biāo)記示蹤物，利用抗原抗體的特異性結(jié)合實(shí)現(xiàn)對目標(biāo)物的檢測的新技術(shù)，并對其檢測性能進(jìn)行

3、了分析，將免疫層析技術(shù)成功的轉(zhuǎn)移至毛細(xì)管中進(jìn)行，命名為膠體金免疫層析毛細(xì)管（capillary immunochromatographic assay CICA）。論文的主要研究結(jié)果如下:
　　本論文首先利用檸檬酸鈉還原法制備了3種不同粒徑的膠體金粒子，在最優(yōu)條件下制備了膠體金標(biāo)記抗體復(fù)合物。最終根據(jù)膠體金標(biāo)記抗體復(fù)合物的穩(wěn)定性、抗原結(jié)合能力選擇13nm的膠體金粒子標(biāo)記抗體制備免疫檢測探針用于后續(xù)的實(shí)驗(yàn)。對清洗活化后的玻璃毛細(xì)管使

4、用γ-縮水甘油醚氧基丙基三甲氧基硅烷（GPTMS）進(jìn)行修飾，將包被原和二抗共價(jià)結(jié)合在毛細(xì)管的特定位置作為檢測區(qū)和質(zhì)控區(qū)，組裝了新型的用于小清蛋白快速檢測的免疫層析毛細(xì)管。
　　對毛細(xì)管的修飾時(shí)間和檢測條件進(jìn)行了優(yōu)化，利用最優(yōu)條件下制備的免疫層析毛細(xì)管實(shí)現(xiàn)對魚類的主要過敏原小清蛋白的檢測，其視覺檢測限為70ng mL-1，半定量檢測限為40 ng mL-1。對新建方法的檢測性能進(jìn)行分析，并對多種實(shí)際樣品進(jìn)行檢測，表明免疫層析毛細(xì)管具

5、有結(jié)構(gòu)簡單、穩(wěn)定性、重復(fù)性和特異性好等優(yōu)點(diǎn)。
　　為驗(yàn)證新建膠體金免疫層析毛細(xì)管的普遍適用性，研究其是否適合用于對靈敏度要求較高，樣品基質(zhì)更復(fù)雜的小分子物質(zhì)的檢測。參照免疫競爭的原理將呋喃唑酮代謝物的包被原(AOZ-OVA)和羊抗鼠二抗分別共價(jià)固定在修飾后的毛細(xì)管的特定區(qū)域?yàn)闄z測區(qū)和質(zhì)控區(qū)，對毛細(xì)管壁的非特異性結(jié)合位點(diǎn)封閉后便組裝成功了用于呋喃唑酮代謝物快速檢測的CICA。對毛細(xì)管的修飾方法和檢測方法進(jìn)行了詳細(xì)的優(yōu)化，在最優(yōu)條件下

6、其視覺檢測限為0.65 ng mL-1，使用平板掃描儀進(jìn)行半定量測試其檢測限為0.26 ng mL-1，包括樣品前處理的整個(gè)檢測過程在2h內(nèi)可以完成。該方法呈現(xiàn)出對小分子檢測優(yōu)異的靈敏度、重復(fù)性、選擇性，并成功用于多種實(shí)際樣品的檢測。
　　以玻璃材質(zhì)為基底為免疫層析檢測方法的再生提供了可能，也是降低生產(chǎn)成本提高檢測穩(wěn)定性、重復(fù)性和特異性的有效手段。首先優(yōu)選出適合免疫層析毛細(xì)管的解離液:含1％(v/v) DMSO和5％(w/v) S

7、DS的0.1M甘氨酸-鹽酸(pH2.8)緩沖液。對影響再生的條件進(jìn)行優(yōu)化，得出最佳的解離條件為:顯色后60min內(nèi)進(jìn)行解離，解離溫度為20℃，解離時(shí)間為5min。在最優(yōu)條件下用于呋喃唑酮代謝物檢測的免疫層析毛細(xì)管可再生3次，且再生后的靈敏度和穩(wěn)定性不受影響。
　　玻璃材料具有表面光滑、耐高溫、耐高離子強(qiáng)度清洗等優(yōu)點(diǎn)，但要將蛋白質(zhì)固定在其表面首先需要經(jīng)過修飾。本研究探討了玻璃毛細(xì)管表面經(jīng)過氨基、環(huán)氧基、醛基等基團(tuán)的修飾方法。通過手臂

8、或樹枝狀大分子修飾的毛細(xì)管使固定其上的生物材料分子伸出基底有利于維持空間形態(tài)，更易于抗原抗體的結(jié)合，使免疫層析毛細(xì)管呈現(xiàn)出更優(yōu)異的穩(wěn)定性。修飾方法對靈敏度和再生性影響不大。優(yōu)選出最佳的儲(chǔ)存條件為4℃下于PBS液體中儲(chǔ)存。
　　本文以玻璃毛細(xì)管為基底成功組裝了CICA，并對其組建條件進(jìn)行了詳細(xì)優(yōu)化。實(shí)現(xiàn)了對水產(chǎn)品中的大分子和靈敏度要求較高的小分子的檢測;對再生性能進(jìn)行了研究，對適宜構(gòu)建免疫層析毛細(xì)管的修飾方法進(jìn)行探討。目前建立的免疫