新型羥醛縮合酶的發(fā)現(xiàn)及性質(zhì)研究.pdf

1、羥醛縮合反應能形成新的C-C鍵，在合成有機化學中占有重要地位，在工業(yè)中具有很重要的應用價值。本研究旨在利用基因挖礦手段獲得新型羥醛縮合酶基因，在大腸桿菌中表達、純化，并研究它們的催化性能，探索它們在生物催化合成一些重要藥物中間體中的應用。
　　通過基因挖礦獲得了Staphylococcushominis來源的N-乙酰神經(jīng)氨酸裂合酶基因(shnal，AccessionNo.EFS20452.1)，將其構建至pET-28a質(zhì)粒并在大腸

2、桿菌中得到表達，對目的蛋白進行了純化。通過對該酶的酶學性質(zhì)研究發(fā)現(xiàn)，ShNAL為四聚體，裂解方向的最適反應pH為8.0;合成方向的最適反應pH為7.5，最適反應溫度為45℃。在45℃下孵育2h對ShNAL的活力基本無影響，高于45℃時，活力迅速下降。該酶在pH5.0-10.0的環(huán)境中比較穩(wěn)定，4℃下放置24h酶的殘余活力在70％以上。ShNAL對N-乙酰神經(jīng)氨酸(Neu5Ac)、N-乙酰甘露糖胺(Man)和丙酮酸(Pyr)的Km值分別是

3、(4.0±0.2)mmol/L、(131.7±12.1)mmol/L和(35.1±3.2)mmol/L，kcat/Km值分別為1.9L/mmol·s、0.08L/mmol·s和0.08L/mmol·s。由ShNAL催化的N-乙酰甘露糖胺與丙酮酸的縮合反應的轉化率達到了91.5％，產(chǎn)率達到了89.4％。通過ShNAL和N-乙酰葡萄糖胺異構酶的串聯(lián)反應實現(xiàn)了從N-乙酰葡萄糖胺到N-乙酰神經(jīng)氨酸的轉化，轉化率達到了30％左右。同時也對得到的來

4、源于Blastopirellulamarina的N-乙酰神經(jīng)氨酸裂合酶BmNAL(GenBankAccessionNo.ZP_01092134.1)進行構建和表達，對其酶活性質(zhì)進行了鑒定。
　　通過基因比對和挖礦技術我們還得到兩個蘇氨酸醛縮酶，分別來自Deinococcusdeserti(DdTA)和Hoefleaphototrophica(HpTA)，基因信息來自Genbank(AccessionNo.分別為YP_0027855