IL-21在核苷（酸）類藥物治療慢性乙型肝炎患者停藥后的表達(dá)與臨床意義.pdf

1、背景與目的：
　　核苷類藥物(nucleos(t)ide analogues，NAs)是目前治療CHB的常用藥物之一。由于NAs在治療CHB患者過(guò)程中，其應(yīng)答率較高，每日僅需口服一次且副作用小，因此在臨床上被廣泛使用。但又因其治療CHB療程的長(zhǎng)期性與不確定性，臨床上患者自行停藥、不規(guī)范停藥的現(xiàn)象較為常見(jiàn)。CHB患者的不規(guī)范停藥與自行停藥會(huì)引起一系列不良的嚴(yán)重后果，包括病毒反彈、促進(jìn)耐藥與病情的進(jìn)一步進(jìn)展，造成后續(xù)治療困難。NAs抗

2、HBV治療停藥后的持久應(yīng)答是我們期望的滿意治療終點(diǎn)。所謂持久應(yīng)答，是指停藥后至少一年，仍能保持治療結(jié)束時(shí)的完全應(yīng)答，即血清轉(zhuǎn)氨酶復(fù)常、血清HBV DNA陰性且維持HBeAg血清學(xué)轉(zhuǎn)換。
　　近年來(lái)有不少回顧性研究預(yù)測(cè)停藥后持久應(yīng)答，但主要集中在臨床指標(biāo)的分析上，包括患者年齡、血清HBsAg水平、HBeAg血清轉(zhuǎn)換時(shí)HBV DNA水平、cccDNA水平、乙型肝炎病毒核心抗原相關(guān)抗原(HBcrAg)水平、口服NAs患者獲得應(yīng)答的時(shí)間和

3、NAs鞏固治療時(shí)間等，較為一致的結(jié)論是:患者年齡越小、停藥時(shí)血清HBsAg水平越低、HBeAg血清轉(zhuǎn)換時(shí)HBV DNA水平越低、肝組織中cccDNA水平越低、血清HBcrAg水平越低、NAs治療中獲得完全應(yīng)答時(shí)間越短、取得完全應(yīng)答后NAs鞏固治療時(shí)間越長(zhǎng)，停藥后復(fù)發(fā)的機(jī)會(huì)越少。
　　然而，隱藏在這些臨床常規(guī)指標(biāo)后面的免疫學(xué)參數(shù)、以及其免疫控制持久應(yīng)答的機(jī)制，尚待深入研究。白細(xì)胞介素-21（IL-21）是一種主要由活化的CD4+T細(xì)

4、胞、NKT細(xì)胞和Th17細(xì)胞產(chǎn)生的多功能細(xì)胞因子。IL-21與IL-2、IL-4、IL-7、IL-9和IL-15一樣擁有相同的細(xì)胞因子受體γ鏈即γc。它的多效性表現(xiàn)在:調(diào)控免疫球蛋白的生成，引導(dǎo)終末期B細(xì)胞分化成漿細(xì)胞，協(xié)同地?cái)U(kuò)展CD8+T細(xì)胞的增殖，引導(dǎo)Th17的分化，對(duì)樹(shù)突狀細(xì)胞的抗原提呈有抑制作用，可以促進(jìn)B細(xì)胞和NK細(xì)胞凋亡。此外，IL-21具有抗腫瘤效應(yīng)的可能，與病毒感染性疾病的發(fā)展相關(guān)。因此在體內(nèi)調(diào)控IL-21的活動(dòng)對(duì)于一部

5、分疾病具有臨床應(yīng)用的潛力。
　　本研究通過(guò)隨訪并檢測(cè)經(jīng)NAs治療停藥后的CHB患者血清病毒學(xué)及生化學(xué)指標(biāo)，探討預(yù)測(cè)停藥后持久應(yīng)答的臨床指標(biāo);通過(guò)檢測(cè)停藥患者血清IL-21的水平，探討IL-21與停藥后持久應(yīng)答的相關(guān)性;通過(guò)檢測(cè)停藥患者機(jī)體HBV-特異性CD8+T細(xì)胞功能，分析血清IL-21水平與CD8+T細(xì)胞應(yīng)答的關(guān)系，探討停藥患者維持持久應(yīng)答的可能機(jī)制，為拓展IL-21和相關(guān)免疫細(xì)胞在慢性HBV感染者中的臨床應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù)。<

6、br>　　方法：
　　1.停藥后臨床指標(biāo)的檢測(cè)
　　對(duì)于治療前HBeAg陽(yáng)性停藥患者，持續(xù)口服NAs治療至HBV DNA在檢測(cè)線以下、谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)復(fù)常、HBeAg發(fā)生血清轉(zhuǎn)換后再繼續(xù)鞏固治療至少12個(gè)月;對(duì)于治療前HBeAg陰性患者，治療至HBV DNA在檢測(cè)線以下、ALT復(fù)常后再繼續(xù)鞏固治療至少18個(gè)月。所有病例均排除甲、丙、丁、戊型肝炎及其他病毒感染及自身免疫性肝病、肝硬化、肝細(xì)胞癌等。篩選合格患者按停藥標(biāo)準(zhǔn)停藥

7、，停藥后納入我們的密切跟蹤隨訪系統(tǒng)。所有受試者各隨訪點(diǎn)采清晨空腹靜脈血30ml:其中抗凝血20ml，采用密度梯度離心法分離外周血單個(gè)核淋巴細(xì)胞(peripheral blood mononuclear cell，PBMC)，-80℃保存;促凝血10ml，離心后取上清置PC管中-20℃保存，同批檢測(cè)。
　　本項(xiàng)研究已經(jīng)在世界衛(wèi)生組織國(guó)際臨床試驗(yàn)注冊(cè)平臺(tái)注冊(cè)(注冊(cè)號(hào):ChiCTR-ONRC-12002315)。經(jīng)南方醫(yī)科大學(xué)南方醫(yī)院倫

8、理委員會(huì)審批，本臨床研究已經(jīng)通過(guò)并批準(zhǔn)進(jìn)行(NFEC-201209-K3)。本研究每位入選患者都給予充分知情同意并書(shū)面簽署知情同意書(shū)。
　　臨床指標(biāo)的實(shí)驗(yàn)室檢測(cè):生化學(xué)檢測(cè):采用Olympus AU5400全自動(dòng)生化分析儀。病毒學(xué)檢測(cè):HBV DNA定量檢測(cè)采用Combas熒光定量PCR法分析，采用微粒子化學(xué)發(fā)光法檢測(cè)HBV血清標(biāo)志物（HBsAg、 HBsAb、HBeAg、 HBeAb和HBcAb）。
　　2.血清IL-21

9、水平的檢測(cè)
　　采用雙抗體夾心ELISA(eBioscience，San Jose，CA，USA)方法檢測(cè)受試者血清IL-21水平。嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行，取受試者血清及標(biāo)準(zhǔn)品各100ul加入酶標(biāo)板，其中標(biāo)準(zhǔn)品做倍比稀釋。終止反應(yīng)后，采用酶標(biāo)儀(FACSCalibur，BD，USA)測(cè)定吸光度(OD)值，以O(shè)D值計(jì)算IL-21水平。
　　3.HBV-特異性T細(xì)胞應(yīng)答的檢測(cè)
　　復(fù)蘇凍存的PBMC，分為HBV核心肽庫(kù)刺

10、激孔與再刺激孔進(jìn)行鋪板，第四天加入IL-2，刺激十天后，采用細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞因子染色(Intracellular cytokinestaining，ICS)檢測(cè)，檢測(cè)前加入蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)抑制劑(Brefeldin A，BFA)孵育5小時(shí)。表面標(biāo)記抗體:7AAD-Percp，anti-CD3-FITC，anti-CD8-APC，胞內(nèi)標(biāo)記抗體:anti-IFN-γ-PE，洗滌后加300ul2％多聚甲醛固定，上機(jī)檢測(cè)。結(jié)果計(jì)算:以再刺激孔IFN-γ+CD

11、8+T細(xì)胞頻數(shù)減去未再刺激孔 IFN-γ+CD8+T細(xì)胞頻數(shù)大于0為HBV-特異性CD8+T細(xì)胞陽(yáng)性。
　　結(jié)果：
　　1.CHB患者經(jīng)NAs治療停藥后臨床指標(biāo)對(duì)持久應(yīng)答的預(yù)測(cè)作用
　　60例符合停藥標(biāo)準(zhǔn)的CHB患者停藥，經(jīng)51.3±1.9(48-56)周的隨訪，病毒學(xué)復(fù)發(fā)患者24例(40％)，其中臨床復(fù)發(fā)13例(21.6％)（6例復(fù)發(fā)點(diǎn)為停藥后第12周;7例復(fù)發(fā)點(diǎn)為停藥后第24周），對(duì)于臨床復(fù)發(fā)患者再次予核苷類藥物抗

12、病毒治療，同時(shí)本停藥研究的隨訪結(jié)束，納入普通隨訪;持續(xù)應(yīng)答患者36例。持續(xù)應(yīng)答組患者在停藥基線年齡及HBsAg滴度顯著低于病毒學(xué)復(fù)發(fā)組(p=0.03，p=0.001)，但在性別比例、治療前HBeAg狀態(tài)、總治療時(shí)間、應(yīng)答時(shí)間以及鞏固治療時(shí)間上均無(wú)顯著差異。
　　2.停藥患者血清IL-21水平的動(dòng)態(tài)變化
　　60例CHB患者停藥基線、停藥后第12周、第24周、第48周血清IL-21水平依次為40.90pg/ml(24.50-1

13、82.44pg/ml)、42.71p g/mi(24.50-156.16.17pg/ml)、42.68pg/ml(25.92-215.48pg/ml)、42.90pg/ml(27.35-200.85pg/ml)，停藥后第12周、第24周、第48周與停藥基線相比均無(wú)顯著性差異;病毒學(xué)復(fù)發(fā)組停藥基線、停藥后第12周、第24周、第48周血清IL-21水平依次為42.68pg/ml(25.92-182.44pg/ml)、41.48pg/ml(2

14、4.50-150.16pg/ml)、45.68pg/ml(28.77-215.48pg/ml)、42.64pg/ml(27.35-200.85pg/ml)，其中停藥后第12周、第24周、第48周與停藥基線相比均無(wú)顯著性差異。持續(xù)應(yīng)答組停藥基線、停藥后第12周、第24周，第48周血清IL-21水平依次為39.59pg/ml(24.50-117.16pg/ml)、42.71pg/ml(25.92-114.53pg/ml)、40.84pg/m

15、l(25.92-118.48pg/ml)、43.52pg/ml（28.77-128.65pg/ml），其中停藥后第12周、第24周、第48周顯著高于停藥基線（分別p=0.0035，p=0.0124，p=0.0002）。
　　3.血清IL-21水平與血清HBsAg滴度及HBV DNA水平的關(guān)系
　　病毒學(xué)復(fù)發(fā)組血清HBV DNA水平隨著隨訪時(shí)間延長(zhǎng)呈持續(xù)上升趨勢(shì)，血清HBsAg滴度無(wú)明顯變化，血清IL-21水平亦無(wú)明顯變化。而

16、在持續(xù)應(yīng)答組血清HBV DNA水平隨著隨訪時(shí)間延長(zhǎng)，呈持續(xù)穩(wěn)定低水平，血清HBsAg滴度亦無(wú)明顯變化，但血清IL-21水平在隨訪過(guò)程中呈穩(wěn)定高水平狀態(tài)。60例停藥患者總血清IL-21水平與血清HBsAg滴度及HBV DNA水平間均無(wú)顯著相關(guān)性;病毒學(xué)復(fù)發(fā)組及持續(xù)應(yīng)答組血清IL-21水平與血清HBV DNA水平無(wú)顯著相關(guān)性;病毒學(xué)復(fù)發(fā)組血清IL-21水平與血清HBsAg滴度呈正相關(guān)(r=0.290，p=0.01)，持續(xù)應(yīng)答組血清IL-21

17、水平與血清HBsAg滴度呈負(fù)相關(guān)(r=-0.328，p＜0.0001)。
　　4.HBV-特異性T細(xì)胞應(yīng)答
　　我們對(duì)20例HLA-A2陽(yáng)性患者停藥基線HBV-特異性T細(xì)胞應(yīng)答進(jìn)行檢測(cè)，HBV-特異性T細(xì)胞應(yīng)答檢出率為30％(6/20)，而IFN-γ+CD8+T細(xì)胞百分比為0.133％±0.062％（0.054％-0.228％），HBV-特異性T細(xì)胞應(yīng)答在病毒學(xué)復(fù)發(fā)組與持續(xù)應(yīng)答組患者分別檢出2例(2/11)和4例(4/9)，