同步檢測(cè)頭孢類抗生素與鏈霉素膠體金免疫層析法的建立.pdf

1、頭孢類抗生素和鏈霉素都具有抗菌譜廣、殺菌能力強(qiáng)的特點(diǎn)，因而在獸醫(yī)臨床上被廣泛應(yīng)用于治療禽畜細(xì)菌感染等疾病，這兩類藥物又經(jīng)常聯(lián)用以增強(qiáng)治療效果，這樣增加禽畜機(jī)體內(nèi)藥物的殘留，通過(guò)食物鏈蓄積在人體內(nèi)，給人類的健康造成嚴(yán)重的危害。因此，為減少這兩類藥物殘留對(duì)人健康的危害，必須要加強(qiáng)對(duì)動(dòng)物源性食品中這兩類藥物殘留的檢測(cè)，建立一種靈敏度高，操作簡(jiǎn)便的方法具有十分重要的意義。
　　 1.人工抗原的合成及多克隆抗體的制備
　　 選取7

2、-氨基頭孢烷酸(7-ACA)、頭孢拉定(CED)、頭孢氨芐(CEX)采用戊二醛法分別與牛血清蛋白(BSA)相結(jié)合制備免疫抗原、與卵清白蛋白(OVA)偶聯(lián)制備包被抗原。采用化學(xué)交聯(lián)法將鏈霉素(SM)分別與BSA和OVA偶聯(lián)制備免疫抗原SM-BSA與包被抗原SM-OVA。人工抗原經(jīng)紫外掃描和SDS-PAGE蛋白電泳鑒定陽(yáng)性，紫外光譜掃描法計(jì)算7-ACA-BSA、CED-BSA、CEX-BSA以及SM-BSA結(jié)合比分別為14.34、15.62

3、、12.29、15.21。用此四種抗原免疫新西蘭白兔得到抗血清，經(jīng)過(guò)ELISA測(cè)定抗血清效價(jià)，抗7-ACA-BSAIgG、抗CED-BSAIgG、抗CEX-BSAIgG以及抗SM-BSAIgG的效價(jià)分別為：12800、64000、64000、64000。結(jié)果表明：偶合成功，結(jié)合比恰當(dāng)。所得抗血清效價(jià)符合實(shí)驗(yàn)要求。
　　 2.抗體交叉反應(yīng)性的測(cè)定
　　 經(jīng)過(guò)優(yōu)化建立了間接ELISA的檢測(cè)方法，通過(guò)交叉反應(yīng)性的測(cè)定篩選出抗C

4、EX-BSAIgG對(duì)頭孢類藥物有較好的交叉反應(yīng)性，交叉反應(yīng)率達(dá)到53.4％～101％，而抗SMIgG對(duì)硫酸鏈霉素及雙氫鏈霉素有較好的交叉反應(yīng)性交叉反應(yīng)率達(dá)到85％～101％。鏈霉素與頭孢類抗生素之間的交叉反應(yīng)率卻小于0.1％。因此選擇抗CEX-BSAIgG為研制檢測(cè)頭孢類抗生素試紙條的抗體。
　　 3.金標(biāo)抗體的制備及單一檢測(cè)試紙條的制備
　　 將純化后的抗體蛋白與制備的粒徑為18nm的膠體金相結(jié)合制備成金標(biāo)蛋白，并且對(duì)

5、試紙條的組成材料和各條件進(jìn)行優(yōu)化后，將試紙條各組分按順序組裝好，并對(duì)試紙條性能進(jìn)行測(cè)試，頭孢氨芐檢測(cè)試紙條在PBS和牛奶基質(zhì)中對(duì)頭孢氨芐的最低檢測(cè)限分別為10ng/mL和80ng/mL，在牛奶基質(zhì)中對(duì)其他頭孢類抗生素的最低檢測(cè)限都在500ng/mL之內(nèi)；鏈霉素檢測(cè)試紙條在PBS和牛奶基質(zhì)中對(duì)鏈霉素的最低檢測(cè)限分別為150ng/mL和400ng/mL，牛奶基質(zhì)中對(duì)硫酸鏈霉素和雙氫鏈霉素的最低檢測(cè)限在1000ng/mL以內(nèi)。表明研制的試紙條

6、的特異性和靈敏度等性能基本符合檢測(cè)要求。
　　 4.雙元檢測(cè)試紙條的組裝及性能測(cè)定
　　 將頭孢類抗生素及鏈霉素雙元檢測(cè)免疫層析試紙條組裝好，其在PBS及牛奶基質(zhì)中對(duì)頭孢氨芐的最低檢測(cè)限分別為20ng/mL和100ng/mL，對(duì)鏈霉素的最低檢測(cè)限分別為200ng/mL和500ng/mL。在牛奶中對(duì)其他β-內(nèi)酰胺類抗生素的最低檢測(cè)限都在1000ng/mL之內(nèi)；對(duì)雙氫鏈霉素和硫酸鏈霉素的檢測(cè)最低檢測(cè)線都在1000ng/mL之