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文檔簡介
1、目的:本課題在當(dāng)今檢驗醫(yī)學(xué)發(fā)展提出的POCT(PointOf Care Testing),即即時檢驗新領(lǐng)域背景下,致力于開發(fā)一種新的檢測試劑即熒光免疫層析快速檢測試劑盒,使用小型熒光免疫分析儀進行檢測,花費時間在15分鐘左右,因此簡單、便捷,標本即到即檢,既能解決病人等待時間長之問題,又能解決臨床醫(yī)生執(zhí)行自身免疫性疾病臨床診斷的路徑問題,可以在各級醫(yī)院臨床推廣使用,以提高自身免疫疾病的診治水平。
熒光免疫層析檢測法是一種將免疫
2、側(cè)向?qū)游黾夹g(shù)、鏈霉親和素-生物素放大系統(tǒng)和熒光檢測技術(shù)三者結(jié)合起來的一種檢測技術(shù),該技術(shù)首次將熒光蛋白作為其標記物并結(jié)合了鏈霉親和素-生物素放大系統(tǒng),不僅提高了快速檢測的穩(wěn)定性也提高了試劑檢測的靈敏性。同時檢測速度快,整個分析過程只需要十五分鐘左右。這種技術(shù)是課題組的多項專利技術(shù)融合,將它用于抗核抗體的快速篩查檢測試劑盒的研發(fā),可以填補抗核抗體的快速篩查領(lǐng)域中的空白。
綜上所述,本課題擬采用熒光免疫層析法用熒光免疫分析儀來檢測
3、血清標本中ANA及dsDNA,開發(fā)快速檢測試劑盒,可用于AID的早期篩查和病情監(jiān)控。
方法:1、抗原的制備、純化、鑒定及固化
1.1、抗原制備、純化、鑒定:
根據(jù)自身免疫性抗原自身特點采取有效的方法(如基因工程合成、質(zhì)粒提取DNA等)制備抗原,純化后利用商品化的單克隆抗體檢測試劑盒和確診為相關(guān)自身免疫疾病且ANA或dsDNA陽性的血清進行驗證,以驗證制備的抗原是否合格,然后進一步純化濃縮,保證靶抗原的豐度與
4、純度。最后鑒定經(jīng)過純化濃縮處理后的抗原是否符合進一步研究的要求。
1.2、抗原固化:
以PBS緩沖液系統(tǒng)稀釋提取抗原至合適濃度,固定于NC膜上;加入待測不同稀釋度的陽性標本,根據(jù)熒光強度調(diào)整緩沖液成分。對固化過程中的環(huán)境條件,分別在濕度45%、50%、55%和60%進行,以劃線粗細均勻,無明顯擴散、無明顯疏水斑為佳;在穩(wěn)定性能上,分別保存1、3、5、7、10天,用陽性標本檢測比較熒光強度。
2、熒光蛋白與抗
5、體的結(jié)合
生物素標記鼠抗人IgG抗體:用PBS溶液將待標記抗體稀釋至相應(yīng)濃度,放入適當(dāng)?shù)碾x心管中;DMF將生物素溶解至相應(yīng)濃度,加入待標記抗體中,充分反應(yīng)后,根據(jù)反應(yīng)體系大小,加入一定量的0.1M的NH4Cl,終止標記。4℃透析除去多余的生物素和NH4Cl,透析好的標記抗體放入-20℃長期保存,或4℃保存近期實驗備用。
鏈霉親和素標記熒光蛋白:從GeneBank中調(diào)取鏈霉親和素基因sa、藻藍蛋白β亞基cpcB、裂合酶
6、基因alr0617、藻紅膽素合成酶基因ho1、pebA和pebB的序列,設(shè)計引物,以藻總DNA作為模板進行PCR擴增獲取目的片段轉(zhuǎn)入質(zhì)粒,選擇同時攜帶鏈霉親和素與藍藻蛋白cpcB的融合基因,以及Histag標簽。通過培養(yǎng)含有質(zhì)粒的大腸工程菌,進行融合蛋白的表達,鑒定及純化,獲取鏈霉親和素標記熒光蛋白。
熒光蛋白與抗體結(jié)合能力檢測:將生物素標記鼠抗人IgG抗體包被在96孔板,加入一定濃度的鏈霉親和素標記熒光蛋白,通過微孔板檢測儀
7、檢測熒光強度檢測鏈霉親和素標記熒光蛋白與鼠抗人IgG抗體結(jié)合能力。
3、測試卡的制備及組裝
(a)樣品墊,以玻璃纖維膜為載體,經(jīng)樣品墊處理液浸泡處理,烘干;(b)熒光蛋白結(jié)合墊,以玻璃纖維膜為載體,經(jīng)結(jié)合墊處理液浸泡處理,烘干,將熒光蛋白經(jīng)緩沖液稀釋后,均勻噴在纖維膜上,烘干;(c)生物素化鼠抗人IgG抗體結(jié)合墊,以玻璃纖維膜為載體,經(jīng)結(jié)合墊處理液浸泡處理,烘干,將生物素化鼠抗人IgG抗體經(jīng)緩沖液稀釋后,均勻噴在纖維
8、膜上,烘干;(d)NC膜,結(jié)合有檢測用固相抗原(檢測線T)和質(zhì)控用IgG抗體(質(zhì)控線C;本研究dsDNA系統(tǒng)用羊抗兔IgG、ANA系統(tǒng)用羊抗鼠IgG),分別將抗原和羊抗兔(鼠)IgG抗體經(jīng)緩沖液稀釋后,用劃膜儀均勻劃至NC膜上,烘干;(e)吸水墊(f)底板,PS底板,帶有不干膠,作為各成分粘貼的載體;上述(a)-(e)組分按順序和層疊次序粘貼于PS底板上,切為4mm寬條狀,得到測試條;(g)卡殼:依據(jù)測試條的組分分布設(shè)計模具,塑料成型制
9、成卡殼;將測試條裝入其中,完成測試卡制備。
4、試劑盒反應(yīng)條件優(yōu)化及性能評價
通過優(yōu)化篩選合適的抗原抗體,優(yōu)化抗原抗體反應(yīng)濃度、反應(yīng)時間、緩沖液體系、加樣體積等參數(shù),提高試劑盒準確性、精密度、靈敏度、特異性和穩(wěn)定性,并形成穩(wěn)定的生產(chǎn)工藝。對試劑盒進行性能評價,主要指標為:線性范圍、精密度、靈敏度、特異性和穩(wěn)定性。通過現(xiàn)有檢測方法和研制的快速篩查測試卡檢測結(jié)果相比較,評價結(jié)果的一致性,評價抗核抗體快速篩查試劑盒的臨床使
10、用效果。
結(jié)果:1、抗ds-DNA抗體檢測試劑盒研制開發(fā)
1.1、生物素標記dsDNA抗原(Biotin-dsDNA)的制備:選擇pGEM-T載體,pb3433,用LB培養(yǎng)基培養(yǎng)18h集菌后用堿裂解法提取其質(zhì)粒DNA。使用限制性核酸內(nèi)切酶將dsDNA切成具有粘性末端(游離氨基-NH2)的線性dsDNA,按照5mg/mL生物素酰肼水溶液∶5%戊二醛∶dsDNA水溶液=5∶6∶10比例混合攪勻,通過化學(xué)交聯(lián)劑把活化的BS
11、A與具有游離氨基的線性dsDNA連接,形成dsDNA-BSA包被抗原。
1.2、熒光探針制備:選擇Merck Millipore Corporation公司的熒光微球,完成鼠抗人IgG與熒光微球偶聯(lián)優(yōu)化,最終確定將活化好的熒光微球調(diào)節(jié)pH值到7.2-7.4,加入抗體∶微球比例為1∶6,30℃反應(yīng)30min性能為最佳。
1.3、反應(yīng)條件優(yōu)化、性能評價及臨床比對分析:確定樣本稀釋比例為1∶49(稀釋50倍)本底抗干擾能力
12、及靈敏度陰陽性符合率最佳。其檢測范圍為5.0-600.0IU/mL。批內(nèi)精密度為8.50%,批間精密度為8.58%,分析靈敏度(檢測低限)為3.22IU/mL,測試條穩(wěn)定性在2~8℃環(huán)境里可存放12個月。通過樣本測試比對分析,與廣州南杰生物技術(shù)有限公司抗雙鏈DNA抗體定量檢測試劑盒(ELISA方法)之間具有很好的一致性,符合率>95%,其可較好的滿足臨床使用的要求。
2、抗核抗體六聯(lián)檢測試劑盒研制開發(fā)
2.1、抗原制
13、備:通過基因合成所需的蛋白類核抗原,并成功進行表達鑒定。
在NCBI上查詢臨床常見的人自身抗原的堿基序列和氨基酸序列,運用軟件預(yù)測抗原表位,選擇抗原表位并對密碼子進行偏嗜性改造,采用人工合成方法合成抗原表位序列并插入至原核表達載體pET30a中。將重組質(zhì)粒導(dǎo)入大腸桿菌BL21經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達,表達的重組蛋白用鎳離子親和層析柱純化,用熒光免疫法測定重組蛋白活性。
2.2、抗原固定:對6種抗原52-kD Ro/SSA、
14、rRNP、Jo-1、SmD1、Scl-70 SSB-La進行固定,6種抗原按1∶1∶1∶1∶1∶1混合均勻,在50℃烘箱烘干6小時,固定效果最佳。
2.3、熒光探針制備:鼠抗人IgG生物素標記條件優(yōu)化,確定生物素:標記抗體=0.25∶1,30℃水浴30min,PH=7.2-7.4標記效果最穩(wěn)定。對生物素標記抗體濃度及熒光蛋白濃度比例進行了調(diào)試,確定了最佳的配比濃度(生物素標記抗體濃度為0.4ug/mL∶熒光蛋白濃度為0.6U/
15、L)30℃反應(yīng)30min性能為最佳。
結(jié)論:1、本課題分析基因組雙鏈DNA由于分子量過大容易導(dǎo)致NC膜層析堵塞,樣本無法層析;而進行酶切處理容易導(dǎo)致分子大小不均一,批間差異可控度低等情況,最后選取低分子量的質(zhì)粒為標記對象,采取堿裂解法提取。其純度高,分子大小均一,批間重復(fù)性可控性好。再經(jīng)過純化、鑒定及固化、熒光蛋白與抗體的結(jié)合、測試卡的制備及組裝、試劑盒反應(yīng)條件優(yōu)化及性能評價四項研究后成功研制了抗雙鏈DNA(ds-DNA)抗體
16、檢測試劑盒(熒光免疫層析法)。該方法可以在15分鐘內(nèi)完成檢測。確定樣本稀釋比例為1∶49(稀釋50倍)本底抗干擾能力及靈敏度陰陽性符合率最佳。其檢測范圍為5.0-600.0IU/mL。批內(nèi)精密度為8.50%,批間精密度為8.58%,分析靈敏度(檢測低限)為3.22IU/ml,試紙條穩(wěn)定性盒在2~8℃環(huán)境里可存放12個月。通過樣本測試比對分析,與廣州南杰生物技術(shù)有限公司抗雙鏈DNA抗體定量檢測試劑盒(ELISA方法)之間具有很好的一致性,
17、符合率達到95%,其可較好的滿足臨床使用的要求。
2、應(yīng)用基因工程方法利用原核表達系統(tǒng)成功表達了人自身抗原52-kDRo/SSA,rRNP,Jo-1,SmD1,Scl-70以及SSB-La等六種抗原。再經(jīng)過純化、鑒定及固化、熒光蛋白與抗體的結(jié)合、測試卡的制備及組裝、試劑盒反應(yīng)條件優(yōu)化等初步研制了抗核抗體六聯(lián)免疫層析檢測方法。該方法可以在15分鐘內(nèi)完成檢測。確定樣本稀釋比例為1∶99(稀釋100倍)本底抗干擾能力及靈敏度陰陽性符
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