HIV自然感染與疫苗誘導(dǎo)產(chǎn)生抗體的快速鑒別診斷試劑盒研制.pdf

1、目前所有候選的人類免疫缺陷病毒(HIV)疫苗均含有多種HIV病毒基因或基因產(chǎn)物并刺激機(jī)體產(chǎn)生相應(yīng)抗體,這些抗體與HIV自然感染產(chǎn)生的抗體幾乎沒(méi)有差異,用目前HIV血清診斷試劑盒診斷為陽(yáng)性,導(dǎo)致誤診。疫苗所致的假陽(yáng)性結(jié)果不僅給疫苗受試者帶來(lái)社會(huì)經(jīng)濟(jì)利益上的損失,精神上的傷害,也妨礙了HIV疫苗研究的發(fā)展。另外,由于治療性疫苗的應(yīng)用,可使部分疫苗接種者血清病毒載量下降,HIV核酸檢測(cè)呈假陰性結(jié)果,這一結(jié)果可能威脅血制品的安全。Khurana

2、等用HIV陽(yáng)性血清與HIV噬菌體展示文庫(kù)反應(yīng),篩選到能區(qū)分HIV自然感染產(chǎn)生抗體和注射疫苗產(chǎn)生抗體的三條特異性HIV抗原肽。本研究擬采用基因重組和化學(xué)合成方式得到這三條特異性肽段,并比較兩種方式產(chǎn)生肽段的特異性和靈敏度,用特異性和靈敏度皆優(yōu)的肽段制備HIV膠體金快速層析聯(lián)檢試劑盒,該試劑盒不僅可以用于HIV的快速檢測(cè)并能同時(shí)特異區(qū)分疫苗產(chǎn)生的抗體。
　　 本課題成功構(gòu)建了HIV抗原肽(sk1、sk2、sk3及三短肽串聯(lián)融合肽)原

3、核表達(dá)載體,誘導(dǎo)表達(dá)產(chǎn)物通過(guò)免疫印跡檢測(cè)顯示具有生物學(xué)活性,產(chǎn)物通過(guò)親和層析純化獲得純度較高的融合抗原肽。但純化后的抗原肽容易降解,應(yīng)用于試劑盒研制效果不理想?；瘜W(xué)合成多肽(sk1、sk2及sk3)通過(guò)斑點(diǎn)印跡和ELISA檢測(cè)顯示具有較好的靈敏度和特異性,適用于HIV鑒別診斷試劑盒的研制?；贖IV抗原肽研制的膠體金快速層析試劑盒表現(xiàn)出了很好的檢測(cè)靈敏度(92％)和特異性(100%),即這三條多肽能與HIV-1陽(yáng)性血清反應(yīng),而與HIV陰

4、性血清及疫苗誘導(dǎo)血清不發(fā)生反應(yīng)。這一檢測(cè)結(jié)果和基于同樣材料制備的ELISA檢測(cè)試劑盒一致(P＞0.05)。當(dāng)三短肽聯(lián)合重組HIV包膜蛋白gp41和gp36后,試劑盒檢測(cè)靈敏度可達(dá)100%。
　　 本課題最終成功研制了HIV膠體金快速層析檢測(cè)試劑盒,該劑盒不僅可以檢出HIV感染,同時(shí)還可以鑒別診斷HIV疫苗誘導(dǎo)產(chǎn)生的抗體,這為疫苗臨床試驗(yàn)以及HIV感染篩查提供了新的檢測(cè)工具。
　　 第一部分原核表達(dá)以及化學(xué)合成HIV-1抗

5、原肽的生物學(xué)活性研究
　　 目的:獲得特異性和靈敏度皆優(yōu)的HIV-1抗原肽sk1、sk2及sk3,為研制區(qū)分HIV自然感染產(chǎn)生抗體和疫苗誘導(dǎo)產(chǎn)生抗體的鑒別診斷試劑盒奠定材料基礎(chǔ)。
　　 方法:1.原核表達(dá):用PCR及重疊延伸PCR方法從HIV-1 B亞型質(zhì)粒擴(kuò)增得到sk1,sk2,sk3基因序列及三段基因片段的6種連接序列;并分別克隆入原核表達(dá)載體pET32a(+)與pGEX4T-2;重組體經(jīng)IPTG誘導(dǎo)以與His或GS

6、T標(biāo)簽融合方式表達(dá)抗原肽,并經(jīng)Ni-NAT或谷胱甘肽-Sepharose-4B層析柱親和純化;SDS-PAGE檢測(cè)融合肽表達(dá)情況,Western blot分析融合肽的抗原性;利用融合肽制備ELISA試劑盒,分析臨床樣本。2.化學(xué)合成:用化學(xué)合成的方法得到HIV-1抗原肽sk1、sk2及sk3;斑點(diǎn)印跡方法分析化學(xué)合成多肽的抗原性;利用化學(xué)合成多肽制備ELISA檢測(cè)試劑盒,分析臨床樣本。
　　 結(jié)果:1.原核表達(dá):重組肽His-s

7、k1,His-sk123,His-sk213,His-sk231以及GST-sk3,GST-sk123,GST-sk213分別在pET32a(+)與pGEX4T-2表達(dá)載體中以上清表達(dá)形式正確表達(dá);免疫印跡顯示上述7種融合抗原肽均能夠和HIV-1陽(yáng)性血清反應(yīng)而不能與HIV DNA-天壇疫苗免疫血清反應(yīng);ELISA檢測(cè)顯示,重組肽檢測(cè)靈敏度小于50%,特異度小于90%。2.化學(xué)合成:斑點(diǎn)印跡結(jié)果顯示化學(xué)合成多肽中sk1與HIV-1陽(yáng)性血清

8、有很好的反應(yīng)性,sk2和sk3較差;但三多肽均不和HIV陰性血清及HIV天壇疫苗誘導(dǎo)血清反應(yīng),顯示了良好的特異性。ELISA檢測(cè)結(jié)果顯示,三短肽聯(lián)合檢測(cè)靈敏度為92%,特異度達(dá)100%。
　　 結(jié)論:原核表達(dá)的融合多肽不適合應(yīng)用于試劑盒開(kāi)發(fā);化學(xué)合成多肽具有生物學(xué)活性可用于HIV自然感染與疫苗誘導(dǎo)產(chǎn)生抗體的鑒別診斷試劑盒的開(kāi)發(fā)。
　　 第二部分 HIV快速鑒別診斷試劑盒研制
　　 目的:利用化學(xué)合成的多肽研制HI

9、V膠體金快速層析鑒別診試劑盒,該試劑盒不僅可以用于HIV的快速檢測(cè)并能同時(shí)特異區(qū)分疫苗產(chǎn)生的抗體。
　　 方法:化學(xué)合成多肽sk1、sk2及sk3聯(lián)合重組HIV包膜蛋白gp41和gp36用于HIV膠體金快速層析鑒別診斷試劑盒的研制;100份HIV-1陽(yáng)性血清對(duì)其靈敏度進(jìn)行評(píng)價(jià),30份HIV天壇疫苗誘導(dǎo)血清、100份HIV陰性血清、44份HBV陽(yáng)性血清、36份HCV陽(yáng)性血清以及10份TB陽(yáng)性血清對(duì)試劑盒的特異性進(jìn)行評(píng)價(jià);其結(jié)果與E