發(fā)酵冰糖臍橙皮渣生產(chǎn)菌體蛋白研究.pdf

1、柑橘皮渣是柑橘加工后的下腳料，長期以來，柑橘皮渣不能有效利用，甚至造成了嚴(yán)重的環(huán)境污染，在一定程度上影響了柑橘產(chǎn)業(yè)的持續(xù)健康發(fā)展。利用菌種發(fā)酵柑橘皮渣生產(chǎn)菌體蛋白是綜合利用柑橘皮渣的一條經(jīng)濟(jì)合理之路。
　　 本文以湖南特色水果冰糖臍橙為原料，利用混菌固態(tài)發(fā)酵冰糖臍橙皮渣生產(chǎn)菌體蛋白。分別進(jìn)行了優(yōu)良菌種篩選、菌種誘變選育、固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基配方篩選、固態(tài)發(fā)酵工藝條件優(yōu)化、發(fā)酵產(chǎn)物的小鼠急性經(jīng)口毒性實(shí)驗(yàn)等一系列研究實(shí)驗(yàn)，主要研究結(jié)果如下

2、：
　　 1、通過富集分離純化、平板點(diǎn)種、單菌固態(tài)發(fā)酵、混菌固態(tài)發(fā)酵、從霉變橙皮、朽木、土壤樣本中篩選出了有較強(qiáng)利用冰糖臍橙皮渣能力的野生霉菌2株、野生酵母菌1株。通過三菌混合固態(tài)發(fā)酵實(shí)驗(yàn)，產(chǎn)物真蛋白含量達(dá)到8.15％，相比雙霉菌發(fā)酵提高3.43％，相比單霉菌發(fā)酵提高24.61％，與橙皮渣真蛋白含量4.57％相比提高78.34％。通過菌落生長特征、菌株顯微特征、生理生化鑒定實(shí)驗(yàn)初步鑒定本實(shí)驗(yàn)確定采用的混菌發(fā)酵野生菌株分別屬于米曲

3、霉、黑曲霉、釀酒酵母。本實(shí)驗(yàn)將這三株野生菌株編號為M-6、M-24、Y-3。
　　 2、在溫度29℃、發(fā)酵時(shí)間4d、總接種量0.3ml/g、接種比例1:1:1的條件下，以發(fā)酵產(chǎn)物真蛋白含量為指標(biāo)，對發(fā)酵冰糖臍橙皮渣產(chǎn)菌體蛋白的工藝路線進(jìn)行研究，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：使用雙霉菌先接入培養(yǎng)，待24h后再接入酵母菌混合培養(yǎng)的二次發(fā)酵工藝路線，發(fā)酵4d后終產(chǎn)物真蛋白含量比使用雙霉菌與酵母同時(shí)接種進(jìn)行發(fā)酵的一次發(fā)酵工藝路線產(chǎn)真蛋白的含量要高。其發(fā)

4、酵產(chǎn)物真蛋白含量分別為8.82％、8.15％，故決定后續(xù)試驗(yàn)均采用三菌二次發(fā)酵的工藝路線。
　　 3、對野生菌株黑曲霉M-24、米曲霉M-6以纖維素酶活提高為指標(biāo)，進(jìn)行紫外、微波和60Co-γ射線三輪誘變，經(jīng)過誘變其纖維素酶活分別達(dá)到213.19U/g、184.47U/g，與野生菌株相比分別提高了2.26倍、2.17倍。誘變所得突變株編號為黑曲霉Co-H104、米曲霉Co-M112。將誘變所得高纖維素酶活突變株黑曲霉Co-H10

5、4、米曲霉Co-M112與釀酒酵母Y-3采用二次發(fā)酵方式接種于固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基，29℃下培養(yǎng)4d，其發(fā)酵產(chǎn)物的真蛋白含量達(dá)到14.77％，與野生菌株組合發(fā)酵產(chǎn)物真蛋白含量8.82％相比提高67.47％。
　　 4、采用統(tǒng)計(jì)學(xué)方法對固態(tài)發(fā)酵冰糖臍橙皮渣培養(yǎng)基配方進(jìn)行優(yōu)化。通過單因素試驗(yàn)，確定固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基最優(yōu)輔料、氮源、無機(jī)鹽組合為麩皮、硫酸銨、ZnSO4和CaCl2。且通過實(shí)驗(yàn)證明向固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基中添加表面活性劑吐溫-80、吐溫-

6、60對發(fā)酵橙皮渣產(chǎn)菌體蛋白沒有促進(jìn)作用。通過最陡爬坡實(shí)驗(yàn)，確定響應(yīng)面試驗(yàn)的中心點(diǎn)為：麩皮15％、硫酸銨3％、無機(jī)鹽組合0.25％。通過Box-Behnken實(shí)驗(yàn)最終確定培養(yǎng)基最優(yōu)配方為麩皮15％、硫酸銨3.3％、無機(jī)鹽組合0.27％，在此基礎(chǔ)上得到發(fā)酵終產(chǎn)物真蛋白含量為19.97％，與預(yù)測值相近，與培養(yǎng)基配方優(yōu)化前相比提高35.20％。
　　 5、采用統(tǒng)計(jì)學(xué)方法對固態(tài)發(fā)酵冰糖臍橙皮渣的工藝條件進(jìn)行優(yōu)化。通過Plackett-Bu

7、rman試驗(yàn)，確定培養(yǎng)基料水比、發(fā)酵時(shí)間、發(fā)酵溫度為對發(fā)酵產(chǎn)物真蛋白含量有顯著影響的因素，通過最陡爬坡實(shí)驗(yàn)逼近真蛋白產(chǎn)量最大響應(yīng)區(qū)域，確定顯著影響因素的最佳響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)取值水平。利用Box-Benhnken中心組合設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)，確定發(fā)酵時(shí)間4.5d、發(fā)酵溫度30.5℃、培養(yǎng)基料水比1:3，在該最優(yōu)發(fā)酵條件下，產(chǎn)物真蛋白含量達(dá)23.89％，與優(yōu)化前相比，提高了20.08％。
　　 6、通過菌種篩選、誘變育種、培養(yǎng)基配方篩選與發(fā)酵工藝條件

8、優(yōu)化等一系列實(shí)驗(yàn)手段，使發(fā)酵冰糖臍橙皮渣產(chǎn)物的真蛋白含量最終達(dá)到23.89％，與未發(fā)酵的冰糖臍橙皮渣真蛋白含量4.57％相比，提高4.22倍。粗蛋白含量從6.23％提高到28.75％，提高了3.61倍。粗脂肪提高44.23％，粗纖維下降33.33％，粗灰分提高6.08％。由于冰糖臍橙皮渣發(fā)酵產(chǎn)物的主要用途是作為菌體蛋白飼料使用，故所選菌株與其發(fā)酵產(chǎn)物必須對動物無毒害作用。通過做冰糖臍橙皮渣發(fā)酵產(chǎn)物的小鼠急性經(jīng)口毒性實(shí)驗(yàn)，根據(jù)GB1519