雷帕霉素發(fā)酵過程優(yōu)化與高速逆流色譜制備工藝研究.pdf

1、雷帕霉素(Rapamycin)又稱為西羅莫司(Sirolimus)是1975年由Veniza等[1]分離得到的吸水鏈霉菌(Streptomyces hygroscopicus)所產(chǎn)的大環(huán)內(nèi)脂類抗生素。經(jīng)過多年的研究雷帕霉素現(xiàn)己被開發(fā)成為臨床使用的強(qiáng)效免疫抑制劑。由雷帕霉素為前體,化學(xué)修飾合成所得的一些結(jié)構(gòu)新穎衍生物,還被發(fā)現(xiàn)在免疫抑制、抗癌、抗帕金森氏癥與艾滋病等方面上,具有新的治療作用。當(dāng)前采用發(fā)酵法生產(chǎn)雷帕霉素仍存在發(fā)酵產(chǎn)量低、提取

2、路線復(fù)雜等問題,提高雷帕霉素發(fā)酵產(chǎn)量,改進(jìn)現(xiàn)行生產(chǎn)工藝具有重要意義。
　　 本文主要以本實驗保存的吸水鏈霉菌(S.hygroscopicus FMT11)為出發(fā)菌株,開展雷帕霉素發(fā)酵過程優(yōu)化與分離工藝研究。結(jié)合雷帕霉素生物合成途徑,以提高雷帕霉素發(fā)酵強(qiáng)度為目的,在搖瓶條件下,通過單因素篩選實驗,發(fā)酵初始培養(yǎng)基中添加氯化鈷0.05%、L-賴氨酸鹽酸鹽2%、檸檬酸0.08%和L-氨基酸(L-賴氨酸鹽酸鹽、L-酪氨酸、L-谷氨酰胺)能

3、提高雷帕霉素發(fā)酵產(chǎn)量,并結(jié)合響應(yīng)面優(yōu)化方法,獲得最佳的濃度氨基酸混合物(L-賴氨酸鹽酸鹽2%、L-酪氨酸0.4%、L-谷氨酰胺0.3%);同時為強(qiáng)化雷帕霉素產(chǎn)物合成代謝流,發(fā)現(xiàn)72小時補(bǔ)加營養(yǎng)因子玉米漿和硫酸銨能有效提高產(chǎn)量,分別添加玉米漿0.6%和硫酸銨濃度0.2%,雷帕霉素產(chǎn)量分別提高了6.88%和9.47%。基于搖瓶研究,在7L發(fā)酵罐嘗試建立雷帕霉素發(fā)酵過程多階段強(qiáng)化工藝,即在發(fā)酵初始添加L-賴氨酸鹽酸鹽2%,L-酪氨酸0.4%,

4、L-谷氨酰胺0.3%,提高前體供應(yīng)流;同時在產(chǎn)物合成期補(bǔ)加硫酸銨0.2%,提高產(chǎn)物合成代謝流,實現(xiàn)了雷帕霉素高效生產(chǎn)。發(fā)酵結(jié)果表明,204h雷帕霉素發(fā)酵產(chǎn)量達(dá)到860.6mg/l,產(chǎn)率達(dá)到4.21mg/(1·h),分別比原始工藝提高了181.7%和131.32%,發(fā)酵水平尚未見文獻(xiàn)報道。
　　 在提取工藝上,以高速逆流色譜核心,嘗試建立了雷帕霉素快速分離純化工藝方法。發(fā)酵菌絲體經(jīng)丙酮、乙酸乙酯粗提后,采用高速逆流色譜法(HSCC