全谷豆包植物活性成分及其改善HepG2細(xì)胞胰島素抵抗作用與AMPK通路機(jī)制探討.pdf

1、目的:(1)提取熟化前后全谷豆包中膳食纖維(DF）、類黃酮(FN)、酚酸(PAD)和植物固醇(PS)，測定其含量和體外抗氧化能力，了解全谷豆包中活性成分提取物產(chǎn)生生物學(xué)效應(yīng)的物質(zhì)基礎(chǔ);
　　(2)觀察全谷豆包中活性成分提取物對棕櫚酸(PA）誘導(dǎo)的HepG2細(xì)胞胰島素抵抗作用的影響，測定細(xì)胞對葡萄糖的消耗量與細(xì)胞中甘油三酯(TG)、丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)和谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-PX)的含量，闡明不同種類活性

2、成分提取物對HepG2細(xì)胞胰島素抵抗作用的干預(yù)效果差異;
　　(3)觀察全谷豆包中活性成分提取物對胰島素抵抗HepG2細(xì)胞中的腺苷酸活化蛋白激酶α2(AMPKα2)、乙酰輔酶A羥化酶(ACC1)、脂肪酸合成酶(FAS)、葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白2(GLUT2)、過氧化物酶體增殖物活化受體γ協(xié)同激活因子-1(PGC-1)在mRNA水平上的影響，探討全谷豆包中活性成分對胰島素抵抗HepG2細(xì)胞的作用機(jī)制;
　　(4)比較熟化對全谷豆包中活

3、性物質(zhì)及其改善HepG2細(xì)胞胰島素抵抗作用的影響效果。
　　方法:(1)用酶-化學(xué)法提取熟化前后全谷豆包中的膳食纖維，按國標(biāo)法測定其含量;用浸提回流法提取熟化前后全谷豆包中的類黃酮，用超聲波萃取法提取熟化前后全谷豆包中的酚酸和植物固醇，用比色法測定其含量。采用DPPH自由基清除法和T-AOC總抗氧化能力檢測法測定不同活性成分提取物的體外抗氧化能力;
　　(2)用棕櫚酸誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞建立體外胰島素抵抗模型，通過MTT、油紅

4、O染色、葡萄糖氧化酶法檢測細(xì)胞對葡萄糖的消耗量以及細(xì)胞中TG的含量，判定胰島素抵抗細(xì)胞模型建立成功，確定棕櫚酸最佳濃度;
　　(3)棕櫚酸誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞胰島素抵抗模型后，加入不同活性成分提取物，測定細(xì)胞對葡萄糖的消耗量與細(xì)胞中TG的含量和抗氧化指標(biāo)MDA、SOD、GSH-PX的含量，半定量PCR測定AMPKα2、ACC1、GLUT2、FAS、PGC-1的基因表達(dá)。
　　結(jié)果:(1)熟化前全谷豆包中膳食纖維的含量為17.5

5、g/100g，類黃酮的含量為2.28g/100g，酚酸的含量為0.62g/100g，植物固醇的含量為4.60g/100g，熟化后全谷豆包中膳食纖維的含量為21.6g/100g，類黃酮的含量為3.51g/100g，酚酸的含量為0.52g/100g，植物固醇的含量為5.88g/100g;熟化前后全谷豆包中不同活性成分均具有很強(qiáng)的清除DPPH自由基能力和總抗氧化能力;
　　(2)0.25mM的棕櫚酸對細(xì)胞活性無顯著影響，且細(xì)胞對葡萄糖的

6、消耗量顯著降低，細(xì)胞內(nèi)TG顯著升高，細(xì)胞內(nèi)脂滴蓄積明顯，是誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞形成胰島素抵抗的最佳濃度;
　　(3) MTT實(shí)驗中觀察到，適當(dāng)濃度(200μg/mL)的不同活性成分提取物對PA誘導(dǎo)的胰島素抵抗HepG2細(xì)胞有一定的保護(hù)作用。與類黃酮組、植物固醇組和膳食纖維組相比，酚酸組的保護(hù)作用較弱。油紅O染色結(jié)果也顯示，PA可造成細(xì)胞內(nèi)游離脂肪酸升高，而不同活性成分提取物處理后，可減少細(xì)胞內(nèi)游離脂肪酸的形成。200μg/mL熟化前

7、后全谷豆包中活性成分提取物提高了細(xì)胞對葡萄糖的攝取能力，與陰性對照組差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05），均明顯低于PA模型組(P＜0.05)。與PA模型組相比，降低了細(xì)胞中TG、MDA含量，升高了SOD、GSH-PX含量(P＜0.05），表明熟化前后全谷豆包中活性成分對胰島素抵抗均具有一定的改善作用;
　　(4)與模型組相比，類黃酮組、酚酸組、植物固醇組和膳食纖維組細(xì)胞內(nèi)AMPKα2、GLUT2和PGC-1 mRNA表達(dá)顯著增高，且

8、ACC1和FAS mRNA表達(dá)顯著降低(P＜0.05)。除酚酸組外，其余組的基因表達(dá)改善效果與陰性對照組差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05）。
　　結(jié)論:(1)全谷豆包中富含膳食纖維、類黃酮、酚酸和植物固醇等抗氧化物質(zhì)。這些活性成分具有很強(qiáng)的體外抗氧化能力;
　　(2)0.25mM的棕櫚酸與HepG2細(xì)胞孵育24小時，能使細(xì)胞對葡萄糖的消耗量顯著降低，形成胰島素抵抗細(xì)胞模型;
　　(3)熟化前后全谷豆包中活性成分可以提高H