海洋源嗜酸乳桿菌肽聚糖的免疫效應(yīng)及機(jī)理研究.pdf

1、本文通過分子鑒定技術(shù)和傳統(tǒng)鑒定技術(shù)的多相結(jié)合，探索從海洋浮游生物腸道內(nèi)快速分離嗜酸乳桿菌的方法；然后對其細(xì)胞壁肽聚糖的結(jié)構(gòu)進(jìn)行系統(tǒng)研究，對其分子結(jié)構(gòu)進(jìn)行磷酸化修飾，以提高其水溶性和免疫調(diào)節(jié)活性；最后探討修飾前后肽聚糖結(jié)構(gòu)的變化和對巨噬細(xì)胞免疫因子的影響。主要研究內(nèi)容如下：
　　1.海洋源嗜酸乳桿菌的篩選及鑒定
　　以不同來源的魚腸內(nèi)容物為原料，采用溴甲酚紫—MRS改良培養(yǎng)基進(jìn)行初篩，得到28株乳酸菌疑似菌株。再利用生理生化和

2、分子生物學(xué)手段，從28株疑似菌株中鑒定出2株嗜酸乳桿菌 D1和 B3。通過 DPPH清除率實驗，從2株目的菌株中選取較高清除率的菌株 D1做進(jìn)一步的探究。結(jié)果表明 D1是一株具有高抗氧化能力，并對新霉素、菌必治、丁胺卡那霉素、慶大霉素等常見藥物有一定耐藥性的優(yōu)良嗜酸乳桿菌。
　　2.海洋源嗜酸乳桿菌肽聚糖的制備及其酶法水解
　　以上述 D1作為嗜酸乳桿菌研究菌種，利用傳統(tǒng)的TCA法分離提取此菌的細(xì)胞壁肽聚糖。為了增加肽聚糖的

3、溶解性以便其更好的發(fā)揮效益，將提取出的肽聚糖溶于變?nèi)芫?溶菌酶混合液中，以不溶物含量為指標(biāo)，通過響應(yīng)面法篩選出酶解的最佳工藝，并將原肽聚糖作為對照組，分析最佳工藝的抗氧化能力。結(jié)果分析得出嗜酸乳桿菌肽聚糖的最優(yōu)酶解工藝為：變?nèi)芫?溶菌素(μg:mg)的添加比例為20/1，酶解 pH為6.00，酶解溫度為41℃，酶解時間為16h。并且在提高超氧化物歧化酶的活力與抗超氧陰離子的能力上，酶解優(yōu)化組制備的肽聚糖比原肽聚糖的效果更顯著。

4、>　　3.海洋源嗜酸乳桿菌肽聚糖的磷酸化修飾及其結(jié)構(gòu)分析
　　在80℃的條件，采用混合磷酸鹽（5％三聚磷酸鈉，2％三偏磷酸鈉，pH=6.0）對最優(yōu)酶解工藝條件下制備出的小分子肽聚糖進(jìn)行修飾，得到磷酸化肽聚糖。結(jié)合高效液相、核磁共振、紅外光譜、電鏡以及質(zhì)譜對磷酸化肽聚糖的結(jié)構(gòu)做進(jìn)一步分析。結(jié)果表明肽聚糖磷酸化后其表面親水性及粘附性均有一定增強(qiáng)，磷酸根連接于C環(huán)的OH根上，與文獻(xiàn)報道的磷酸根共價修飾一致。
　　4.海洋源磷酸化嗜

5、酸乳桿菌肽聚糖的免疫效應(yīng)研究
　　以Raw264.7巨噬細(xì)胞為模型，依次將 LPS（0.1?g/ml）、肽聚糖（50?g/ml）、不同濃度的磷酸化肽聚糖（25?g/ml、50?g/ml、100?g/ml）注入已在六孔板內(nèi)孵育的巨噬細(xì)胞培養(yǎng)液中，18小時后觀察其細(xì)胞形態(tài)，用酶聯(lián)免疫試劑盒檢測上清液中 IL-1α，TNF-α以及 GM-CSF這三個細(xì)胞因子的含量，用溶酶體熒光探針法檢測巨噬細(xì)胞溶酶體的變化情況。根據(jù) SPSS分析結(jié)果表