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1、D-泛酸,俗稱維生素B5,可以維持頭發(fā),血液和皮膚的健康,同時(shí)它可以作為輔酶A的前體。目前,主要以D-泛解酸內(nèi)酯和β-丙氨酸為原料通過(guò)化學(xué)法合成D-泛酸。前體D-泛解酸內(nèi)酯主要通過(guò)化學(xué)法合成和水解酶動(dòng)力學(xué)拆分獲得,但化學(xué)法步驟繁瑣,污染環(huán)境,而水解酶拆分過(guò)程中需要化學(xué)外消旋化和酸化內(nèi)酯化過(guò)程,增大了額外的生產(chǎn)成本。因此,開(kāi)發(fā)全新的D-泛解酸內(nèi)酯合成工藝具有非常大的意義。
本文以釀酒酵母基因組為模板,成功克隆出酮泛解酸內(nèi)酯還原酶
2、基因SceCPR1,并成功構(gòu)建了SceCPR1與葡萄糖脫氫酶EsGDH偶聯(lián)的輔酶循環(huán)再生系統(tǒng),即“一菌雙酶”體系,用于高效不對(duì)稱還原酮泛解酸內(nèi)酯獲得D-泛解酸內(nèi)酯;SceCPR1和EsGDH蛋白分子大小分別為35kDa和27kDa。通過(guò)誘導(dǎo)條件優(yōu)化,最終單位濕菌體中SceCPR1和EsGDH的酶活分別為1179.2U/g和442.8U/g。
SceCPR1酶學(xué)性質(zhì)表征發(fā)現(xiàn),其最適的pH為5.5,溫度45℃,并且酶在45℃下容易
3、變性,但當(dāng)添加5mM的NADPH可以保證其溫度穩(wěn)定性;其次,SceCPR1不屬于金屬離子依賴型還原酶,但是5mM的Fe3+以及大多數(shù)有機(jī)溶劑對(duì)酶活力有抑制作用;底物譜研究發(fā)現(xiàn)該酶對(duì)于酮泛解酸內(nèi)酯具有最高的活力,而對(duì)于酮泛解酸以及D-或L-泛解酸內(nèi)酯都無(wú)活力;在低底物濃度條件下,測(cè)定了SceCPR1的動(dòng)力學(xué)參數(shù),SceCPR1對(duì)酮泛解酸內(nèi)酯和NADPH的Km值分別為0.164mM和0.029mM,反應(yīng)的Vmax分別為131.03U/mg和
4、137.81U/mg。
以BL21(DE3)/pACYCDuet1-SceCPR1/EsGDH的凍干細(xì)胞作為生物催化劑,優(yōu)化全細(xì)胞催化條件,確定最適反應(yīng)pH為5.5,溫度35℃,生物催化劑添加量為0.03g/mL,輔底物葡萄糖與底物配比為1.5∶1.0,攪拌速度400rpm;通過(guò)對(duì)底物水解的研究,發(fā)現(xiàn)底物自發(fā)水解是影響產(chǎn)物得率的關(guān)鍵因素。因此,在最適催化條件下,將酮泛解酸內(nèi)酯和葡萄糖溶解于pH2.5的溶液中,采用持續(xù)流加補(bǔ)料的
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