香煙煙霧抑制Nrf2誘導(dǎo)人肺動脈內(nèi)皮細胞衰老在肺血管重塑中的作用.pdf

1、慢性阻塞性肺部疾?。–OPD）的致病原因有很多，但是吸煙在其中占主導(dǎo)地位，COPD患者最嚴(yán)重的并發(fā)癥是肺動脈高壓（PH），PH常常會導(dǎo)致右心衰竭。肺動脈高壓最常引起形態(tài)學(xué)改變就是因平滑肌細胞增殖而導(dǎo)致肺血管結(jié)構(gòu)重塑（PVR），目前PVR的形成機制并不清楚。已知吸煙會刺激細胞產(chǎn)生活性氧族（ROS）并誘導(dǎo)細胞發(fā)生衰老以及端粒長度的縮短[1,2]，衰老的細胞會分泌衰老相關(guān)分泌表型（SASP），SASP中的炎性細胞因子和一些細胞生長因子可誘導(dǎo)肺

2、動脈平滑肌細胞的遷移和增殖。因此，肺血管內(nèi)皮細胞是一種重要的衰老相關(guān)的效應(yīng)細胞，容易在接觸血液的過程中受到血流剪切力和氧化應(yīng)激的刺激產(chǎn)生內(nèi)源性的ROS，而且能夠分泌多種相關(guān)細胞因子，因此在由吸煙引起的血管老化的微環(huán)境中起著關(guān)鍵的作用。核呼吸相關(guān)因子2（Nrf2）是一種抗氧化和抗衰老的重要DNA結(jié)合蛋白，可以調(diào)控下游多種抗氧化相關(guān)基因的表達直接或間接地對抗氧化應(yīng)激。Nrf2/ARE途徑是目前發(fā)現(xiàn)的對抗ROS最重要的信號通路[3]。有研究表

3、明，長期吸煙的COPD患者中Nrf2的表達水平較低，而且此類患者中外周血白細胞的端粒長度較未吸煙的COPD患者明顯縮短，提示COPD是一種典型的衰老過程，Nrf2在COPD發(fā)病過程中發(fā)揮重要作用。目前，關(guān)于吸煙對于影響Nrf2的表達及其在PVR中的作用研究較少。
　　第一部分香煙煙霧刺激可以誘導(dǎo)肺動脈內(nèi)皮細胞DNA損傷以及衰老。
　　目的：探究延長香煙煙霧提取物（Cigarette Smoke Extract CSE）刺激的

4、時間對肺動脈內(nèi)皮細胞（HPAEC）的影響。
　　方法：細胞培養(yǎng)后，香煙煙霧提取物（Cigarette Smoke Extract CSE）刺激不同的時間點，利用流式細胞術(shù)觀察細胞周期、免疫熒光檢測細胞衰老相關(guān)蛋白P21、Real-time PCR檢測p53和p21基因、flow-fish的方法檢測細胞端粒的長度、β-半乳糖苷酶染色檢測細胞衰老情況。結(jié)果香煙煙霧刺激72h后與對照組（0h）相比，細胞周期阻滯明顯（p<0.01）；隨著

5、時間的延長，細胞的端粒長度逐漸縮短(P<0.05)；Real-time PCR結(jié)果顯示衰老相關(guān)標(biāo)記物p53和p21的表達逐漸升高，提示細胞衰老逐漸加重。結(jié)論延長香煙煙霧刺激時間加速肺動脈內(nèi)皮細胞的衰老和DNA的損傷。
　　第二部分 Nrf2在香煙煙霧誘導(dǎo)HPAEC發(fā)生衰老過程中的作用。
　　目的：探究香煙煙霧刺激引起HPAEC產(chǎn)生的影響其內(nèi)在機制以及與nrf2的表達的關(guān)系。
　　方法：研究提示隨著CSE對HPAEC的刺

6、激，Nrf2表達量是先升高后下降的，12小時時表達量最高，72h時表達量降到最低。為了探討cse刺激和Nrf2表達的關(guān)系，分別采取了三種干預(yù)措施，觀察作用效果。第一，在刺激12小時對細胞進行siNrf2的轉(zhuǎn)染，再聯(lián)合CSE刺激觀察細胞的衰老效應(yīng)；第二，構(gòu)建Nrf2的質(zhì)粒并進行轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)染之后利用CSE刺激細胞，觀察72h后相關(guān)基因的表達量；第三，利用Nrf2的激活劑tBHQ觀察激活Nrf2之后對CSE誘導(dǎo)的細胞衰老的變化。利用wester

7、n blot和Real-time PCR的方法檢測Nrf2及其相關(guān)基因DJ-1和下游基因HO-1和NQO1以及衰老相關(guān)基因p53、p21的表達量、利用β—半乳糖苷酶染色檢測細胞衰老。
　　結(jié)果：
　?。?）對細胞進行轉(zhuǎn)染siNrf2之后，細胞的抗氧化作用下降，CSE刺激12h后，細胞相比于未轉(zhuǎn)染的細胞衰老明顯，p53和p21的表達升高。
　?。?）細胞轉(zhuǎn)染Nrf2的質(zhì)粒后，給予CSE刺激72h發(fā)現(xiàn)，細胞的抗氧化作用明顯

8、提高，衰老相關(guān)基因和蛋白的表達量較低。
　　（3）Nrf2的激活劑tBHQ作用后，給予CSE刺激72h，細胞抗氧化作用同樣提高，效應(yīng)與質(zhì)粒轉(zhuǎn)染相同。
　　結(jié)論：Nrf2在吸煙引起的細胞衰老中具有重要作用，短時間的CSE刺激可以激活Nrf2增強細胞的抗氧化作用，但是隨著刺激時間的延長Nrf2的表達下降，細胞逐漸趨于衰老狀態(tài)。
　　第三部分衰老的HPAEC分泌SASP可誘導(dǎo)肺動脈平滑肌細胞的增殖，促進PVR的形成
　

9、　目的：觀察HPAEC在接受CSE刺激衰老后分泌的衰老相關(guān)分泌表型(SASP)是否會誘導(dǎo)肺動脈平滑肌細胞的增殖。
　　方法：運用ELISA方法檢測了時間梯度影響下的HPAEC的分泌物TNF-α、TGFβ1、MCP-1、IL-6、bFGF的濃度，隨著時間的延長SASP的濃度逐漸升高。通過Real-time PCR的方法檢測衰老相關(guān)分泌表型基因在HPAEC中的表達，制備條件培養(yǎng)基對肺動脈平滑肌細胞進行培養(yǎng)觀察，利用CCK8法檢測細胞的

10、增殖，Transwell實驗方法檢測遷移能力，通過流式細胞術(shù)和ki-67蛋白的表達兩種方法確定HPASMC的增殖與HPAEC細胞中Nrf2的表達之間的關(guān)系。結(jié)果：隨著時間的延長，bFGF、IL-6、IL-8、MCP-1、TNF-α、TGF-β1的表達量升高，24h之內(nèi)有下降的趨勢，48h、72h表達量升高明顯（p<0.01）；CCK8檢測發(fā)現(xiàn)，細胞在條件培養(yǎng)基的刺激下，CSE刺激時間越長的培養(yǎng)基，細胞增殖越明顯；條件培養(yǎng)基中72h和48