模擬微重力下人肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡信號(hào)通路及藥物干預(yù).pdf

1、微血管內(nèi)皮細(xì)胞不僅構(gòu)成了血液與組織間的主要屏障,而且是強(qiáng)大的內(nèi)分泌器官和代謝器官,有很強(qiáng)的合成、分泌和降解生物活性物質(zhì)的功能.微血管內(nèi)皮細(xì)胞反應(yīng)異常與充血、出血、水腫、炎癥等多種病理過程有關(guān)。在正常情況下,內(nèi)皮細(xì)胞的增殖率和凋亡率都很低,血管內(nèi)皮細(xì)胞依靠其正常的增殖和凋亡平衡維持著內(nèi)皮細(xì)胞數(shù)量的穩(wěn)定和血管功能的正常.本課題組前期的研究結(jié)果表明模擬微重力可誘導(dǎo)肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞的凋亡,而短時(shí)間內(nèi)內(nèi)皮細(xì)胞大量凋亡將導(dǎo)致增殖和凋亡平衡失調(diào),引起

2、內(nèi)皮細(xì)胞功能障礙,進(jìn)而循環(huán)系統(tǒng)功能受損。因而進(jìn)一步探討凋亡發(fā)生信號(hào)通路并采用藥物干預(yù)抑制凋亡發(fā)生尤為必要。
　　 本工作采用回轉(zhuǎn)器回轉(zhuǎn)模擬微重力效應(yīng)建立模型,首先證實(shí)模擬微重力72h引起人肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞發(fā)生明顯凋亡改變,進(jìn)而對(duì)線粒體凋亡信號(hào)通路及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)凋亡的蛋白及基因進(jìn)行檢測(cè),說明其在凋亡發(fā)生中的作用.之后分別采用紅景天苷(Sal)及左旋硝基精氨酸甲酯(L-NAME)對(duì)失重誘導(dǎo)的凋亡進(jìn)行干預(yù),并探討紅景天苷和NO對(duì)模擬

3、微重力誘導(dǎo)凋亡影響及機(jī)制.主要方法與結(jié)果如下:
　　 一、人肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞應(yīng)用回轉(zhuǎn)器回轉(zhuǎn)72h小時(shí)后,采用TUNEL法及DAPI染色檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況,發(fā)現(xiàn)細(xì)胞凋亡率明顯升高。另應(yīng)用JC-Ⅰ熒光探針檢測(cè)線粒體膜電位的變化,進(jìn)一步驗(yàn)證了凋亡改變.采用Real-titme PCR或Western blot檢測(cè)線粒體通路和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)凋亡通路蛋白及基因(CytC、Caspase9、Caspase3、CHOP、ATF-6、GRP78、

4、Caspase12和JNK)進(jìn)行檢測(cè).最終證實(shí)線粒體通路及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激均參與了模擬微重力誘導(dǎo)的凋亡.
　　 二、紅景天苷(Sal)是從中藥紅景天中分離得到的糖氧苷類化合物,已有研究表明紅景天苷可抑制多種細(xì)胞凋亡.本實(shí)驗(yàn)在細(xì)胞回轉(zhuǎn)前分別加入紅景天苷及紅景天苷+P13K抑制劑(LY294002)干預(yù),72h小時(shí)后通過TUNEL法觀察細(xì)胞凋亡率的變化,發(fā)現(xiàn)紅景天苷干預(yù)后可明顯減輕細(xì)胞凋亡率.通過Western blot檢測(cè)發(fā)現(xiàn)PI3K及

5、p-AKT在回轉(zhuǎn)時(shí)表達(dá)降低,而紅景天苷干預(yù)后兩者表達(dá)上升,并伴隨著Bal-2/BAX比例表達(dá)升高,采用PI3K抑制劑干預(yù)可下調(diào)PI3K及p-AKT表達(dá),凋亡檢測(cè)發(fā)現(xiàn)細(xì)胞凋亡率上升,Bal-2/BAX比例表達(dá)下降,因而推斷紅景天苷可能通過P13K/AKT通路抑制了回轉(zhuǎn)誘導(dǎo)的凋亡.
　　 三、課題組前期研究發(fā)現(xiàn)回轉(zhuǎn)過程中NO升高,其可能為模擬微重力誘導(dǎo)凋亡機(jī)制之一,L-NAME為NOS抑制劑,可以阻斷NO的合成。TUNEL法觀察凋亡