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文檔簡介
1、磷脂酶A2是一種在自然界中廣泛存在的酶類,具有抗腫瘤、抗菌、抗凝血、抗血栓等多種生物學活性,使其在藥物開發(fā)上具有巨大潛力。
本實驗室從長白山白眉蝮蛇蛇毒中純化出一種毒素,序列測定結果表明,該毒素為一種磷脂酶A2同源物,49位為Gln,命名為Gln49-磷脂酶A2(Gln49-phospholipase A2,簡稱Gln49-PLA2)。對Gln49-PLA2的活性進行檢測,結果表明其具有多種生物學活性,如神經(jīng)毒性、肌肉毒性和類
2、絲氨酸蛋白酶活性等,然而磷脂酶水解活性并未被檢測到。序列比對及進化樹分析結果表明,Gln49-PLA2和蛇毒Asp49-PLA2(93%-61%)的親緣性要高于Lys49-PLA2(60%-56%)。生物信息學分析和三級結構模擬表明,Gln49可能是影響Gln49-PLA2磷脂酶催化活性的關鍵因素,因其與江浙蝮蛇Asp49-PLA2相比,在催化反應發(fā)生時,干擾了Ca2+的固定。為了確認49位氨基酸殘基在磷脂酶催化活性上所起的作用,實驗室
3、將Gln49-PLA2的49位氨基酸殘基定點突變?yōu)锳sp,并在大腸桿菌中進行重組表達,結果多為包涵體,不利于蛋白質結構與功能的研究。本論文的研究目的是探究Gln49-PLA2及突變體基因的可溶表達。
本研究利用昆蟲細胞桿狀病毒表達體系對Gln49-PLA2及其突變體基因Asp49-PLA2進行重組表達,在供體質粒pFastBacTM Dual的PH啟動子下游,插入目的基因片段;在另一啟動子P10下游插入增強型綠色熒光蛋白(En
4、hanced green fluorescent protein,EGFP)報告基因。將構建正確的重組供體質粒轉化含病毒基因組的大腸桿菌DH10Bac宿主細胞,提取重組病毒桿粒,脂質體介導轉染昆蟲細胞Sf9,收獲培養(yǎng)上清即為重組病毒儲液,將其感染Sf9細胞,外源表達Gln49-PLA2及其突變體蛋白,SDS-PAGE分析檢測到細胞破碎上清液中存在一條14 kDa左右的蛋白條帶(Gln49-PLA2,Asp49-PLA2)。采用Hitra
5、p SP陽離子交換層析對重組蛋白進行分離純化,質譜鑒定結果表明Gln49-PLA2及突變體Asp49-PLA2在昆蟲細胞中成功表達。純化后Gln49-PLA2蛋白具有與天然酶相同的降解纖維蛋白原的活性,不具有磷脂酶活性,而49位氨基酸殘基改變的Asp49-PLA2蛋白獲得了磷脂酶水解活性,比酶活為3.33 U/μg,但不具有降解纖維蛋白原活性。證實了49位氨基酸殘基Gln是導致Gln49-PLA2磷脂酶活性缺失的主要原因,對其降解纖維蛋
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