Human Cosavirus套式PCR檢測(cè)方法的建立及基因組序列分析.pdf

1、Human cosavirus(HCoSV)屬微小核糖核酸病毒科(Picornaviridae)，為單股正鏈RNA病毒。至今，共分離出五個(gè)病毒種，分別為A，B, C，D，E(Human cosavirus A-E)。雖然HCoSV與臨床癥狀之間的關(guān)系尚不明確，但由于檢出率相對(duì)較高，可能與其他腸道病毒發(fā)生混合感染或是疾病發(fā)生的誘導(dǎo)因素，對(duì)人類健康造成潛在的威脅。因此，建立一種敏感、特異的HCoSV的PCR檢測(cè)方法具有重要意義。本文從HCo

2、SV套式PCR檢測(cè)方法的建立及初步應(yīng)用、病毒基因組序列擴(kuò)增及分析、VP3蛋白的表達(dá)純化等方面進(jìn)行了系統(tǒng)研究，結(jié)果如下:
　　本研究根據(jù)GenBank上發(fā)表的HCoSV序列5’端非編碼區(qū)(5’UTR)設(shè)計(jì)特異性引物，建立了HCoSV套式PCR檢測(cè)方法，通過一系列反應(yīng)條件的優(yōu)化、特異性實(shí)驗(yàn)和敏感性實(shí)驗(yàn)，建立了一種快速、簡潔、準(zhǔn)確的套式PCR方法用于檢測(cè)HCoSV。PCR反應(yīng)目的片段為編碼5’端非編碼區(qū)（5’ UTR）的RNA片段，大小

3、為414bp。優(yōu)化50ul反應(yīng)體系中，退火溫度為55℃，引物終濃度為1umol/L，MgCl2的濃度為1.25mmol/L、Taq酶的濃度為0.1 U/ul。與豬戊型肝炎病毒(Hepatitis E virus，HEV)、豬腸道病毒9型（Enterovirus9，EV9）、星狀病毒(Human Astrovirus, HAstV)、博卡病毒(Human bocavirus，HBoV)、塞弗病毒(Saffold virus, SAFV)等

4、均無特異性反應(yīng)。利用建立的套式PCR方法對(duì)上海地區(qū)248份新鮮采集的糞便樣品（188份腹瀉兒童及60份健康兒童）進(jìn)行初步檢測(cè)。結(jié)果顯示：腹瀉兒童中共有6份為陽性，陽性率為3.2％，健康兒童中有1份為陽性，其陽性率為1.6%，進(jìn)化樹及同源性分析發(fā)現(xiàn)7份陽性樣品中共有5株為HCoSVA種（HCoSV-A），表明HCoSV-A可能為上海地區(qū)的流行毒株。實(shí)驗(yàn)表明，建立的套式PCR方法可用于臨床糞便樣品的檢測(cè)，具有特異、敏感、準(zhǔn)確、簡潔的特點(diǎn)，該

5、方法的建立為HCoSV感染的臨床快速診斷提供了科學(xué)依據(jù)。
　　根據(jù) HCoSV GenBank已知序列信息共設(shè)計(jì)10對(duì)引物，結(jié)合RT-PCR和Genome Walking等技術(shù)對(duì)其中一株病毒的全基因序列進(jìn)行擴(kuò)增，并對(duì)該株病毒的基因序列進(jìn)行分析。結(jié)果顯示：病毒的基因組長度約為7262nt,包括一個(gè)多聚蛋白為2125aa。將擴(kuò)增出的VP3基因片段，克隆到原核表達(dá)載體 pET-30a上，經(jīng)酶切、測(cè)序鑒定后，將重組表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至大腸桿菌B