豬新型小病毒PHoV和PBoV診斷方法的建立、分子流行病學(xué)調(diào)查及基因組序列分析.pdf

1、細(xì)小病毒是嚴(yán)重危害養(yǎng)豬業(yè)的重要病毒。經(jīng)典的豬細(xì)小病毒主要引起豬繁殖障礙。但隨著現(xiàn)代病毒學(xué)研究技術(shù)的快速發(fā)展,新的豬細(xì)小病毒被不斷發(fā)現(xiàn),尤其是最近兩年發(fā)現(xiàn)的豬Hokovirus(PHoV)和豬博卡樣病毒(Porcine Boca-likevirus),引起了獸醫(yī)科研工作者的極大興趣。對(duì)于豬Hokovirus,目前僅有少數(shù)幾個(gè)國(guó)家或地區(qū)的流行病學(xué)資料以及不足10株病毒的全基因組序列,豬Hokovirus在我國(guó)的流行情況如何以及該病毒的遺傳變

2、異等也不是很清楚；而對(duì)于豬博卡樣病毒,目前國(guó)際上還沒(méi)有全基因組序列的報(bào)告,該病毒是否屬于博卡病毒尚需從全基因組水平上進(jìn)一步的證實(shí)。為了從全基因組水平確定豬博卡樣病毒的分類(lèi),同時(shí)調(diào)查我國(guó)豬Hokovirus和豬博卡樣病毒的流行情況,本研究從PCR診斷方法的建立、流行病學(xué)調(diào)查和基因組序列分析等方面開(kāi)展了研究,具體內(nèi)容如下:
　　 1.PHoV診斷方法的建立、分子流行病學(xué)調(diào)查和基因組序列分析
　　 參考豬Hokovirus(P

3、HoV)HK7株(GenBank accession number EU200677)的基因組序列,設(shè)計(jì)了一對(duì)擴(kuò)增PHoV VP1基因的保守區(qū)域352bp片段的特異性引物,建立了檢測(cè)PHoV的PCR診斷方法。試驗(yàn)證實(shí)該方法特異性良好,敏感性高,重復(fù)性良好。用建立的PCR檢測(cè)方法對(duì)華中地區(qū)PHoV的流行情況進(jìn)行了調(diào)查,結(jié)果顯示所檢測(cè)的454份樣品中有123份為PHoV陽(yáng)性,陽(yáng)性率達(dá)27.09％。
　　 設(shè)計(jì)涵蓋PHoV基因組編碼區(qū)

4、的7對(duì)引物,分7段擴(kuò)增獲得了廣西(GX株)、湖北(HB株)、湖南(HN株)的3份陽(yáng)性樣品的全基因組序列片段。利用Seqman軟件將全部序列進(jìn)行拼接,組成PHoV GX株、PHoV HB株、PHoV HN株的全基因組序列。結(jié)果表明:PHoV GX株、PHoV HB株和PHoV HN株基因組全長(zhǎng)分別為5080nt、5080nt和5084nt。與國(guó)際參考毒株HK7株相比,3株國(guó)內(nèi)分離株的編碼區(qū)均不存在堿基的插入與缺失,但PHoV HN株在OR

5、F1至ORF2處的非編碼區(qū)存在4個(gè)堿基的插入或缺失。PHoV GX株,PHoV HB株和PHoV HN株和其它的豬Hokovirus參考株的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)分析結(jié)果顯示,PHoV的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)形成兩個(gè)分支,我國(guó)的PHoV流行毒株序列在一個(gè)分支上,而與德國(guó)分離株關(guān)系相對(duì)較遠(yuǎn)。對(duì)不同PHoV毒株之間的NS1基因核苷酸序列分析結(jié)果顯示:核苷酸同源性為97.2％～100％,氨基酸同源性為97.8％～100％。對(duì)PHoV之間的VP1/2基因核苷酸序列分析

6、結(jié)果顯示:核苷酸同源性為98.1％～99.7％,氨基酸同源性為99.1％～100％。以上結(jié)果表明PHoV NS1和VP1/2基因均具有高度的保守性,且VP1/2基因的保守性稍高于NS1基因。
　　 2.PBoV診斷方法的建立、分子流行病學(xué)調(diào)查和基因組序列分析
　　 參考國(guó)際上報(bào)道的豬博卡樣病毒的部分序列和檢測(cè)方法,設(shè)計(jì)了一對(duì)針對(duì)豬博卡樣病毒保守序列的PCR引物。該引物能特異性擴(kuò)增496 bp的DNA片段。利用建立的豬博卡

7、樣病毒的PCR檢測(cè)方法,對(duì)從華中地區(qū)采集的466份樣品進(jìn)行了檢測(cè),結(jié)果顯示199份為陽(yáng)性,陽(yáng)性率高達(dá)42.7％,表明華中地區(qū)豬博卡樣病毒的感染率相當(dāng)高,應(yīng)該引起養(yǎng)豬業(yè)的重視。
　　 由于目前尚無(wú)豬博卡樣病毒的全基因組序列報(bào)道,本研究通過(guò)設(shè)計(jì)簡(jiǎn)并引物并采用重疊延伸法,分4段獲得了豬博卡樣病毒W(wǎng)H1株的完整編碼區(qū)序列。序列分析結(jié)果顯示:豬博卡樣病毒W(wǎng)H1株的序列長(zhǎng)為4786bp(GenBankaccession number HQ2

8、23038)。與其它已知的博卡病毒,包括人博卡病毒(HBoV)、猩猩博卡病毒(GBoV)、牛細(xì)小病毒(BPV)和犬微小病毒(CnMV)的同源性分別為44％-48％(HBoV)、50％(GBoV)、44％-45％(BPV)、52％-55％(CnMV)。系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)分析表明:豬博卡樣病毒與CnMV、BPV、GBoV和HBoV等博卡病毒有著共同的進(jìn)化起源,而且豬博卡樣病毒與CnMV遺傳距離最近,處于同一系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)分支內(nèi)。根據(jù)豬博卡樣病毒的全基因

9、組序列和進(jìn)化分析,證實(shí)WH1株為豬博卡病毒(PBoV)。
　　 利用GENSCAN軟件對(duì)PBoV基因組DNA結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析,發(fā)現(xiàn)PBoV的基因組由三個(gè)開(kāi)放性閱讀框ORF組成,ORF1編碼非結(jié)構(gòu)蛋白NS1,ORF2編碼結(jié)構(gòu)蛋白VP1/VP2,ORF1與ORF2之間的ORF3編碼博卡病毒特有的NP1蛋白。PBoV NS1基因結(jié)構(gòu)與HBoV NS1基因結(jié)構(gòu)類(lèi)似,都含有比較保守的選擇性剪切和拼接位點(diǎn),推測(cè)PBoV在宿主細(xì)胞內(nèi)可能會(huì)表達(dá)兩種