香港牡蠣中麻痹性貝類毒素結(jié)合蛋白分離純化及構(gòu)效分析.pdf

1、麻痹性貝類毒素(Paralytic Shellfish Poisoning，PSP)是一種可以與細(xì)胞膜離子通道結(jié)合阻礙神經(jīng)傳導(dǎo)，引起神經(jīng)性麻痹的毒素。PSP主要合成于藍(lán)藻，是目前由有害藍(lán)藻引起的中毒事件中最常見的對人體影響較為嚴(yán)重的毒素之一。貝類是海洋中以攝食藻類為主的動物，它們在攝食大量藻類的同時(shí)，會對藻中的物質(zhì)如PSP進(jìn)行富集，人和動物食用后就會導(dǎo)致PSP中毒，帶來嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。
　　本文將產(chǎn)PSP藻——微小亞歷山大藻(Al

2、exandrium minutum)首先進(jìn)行室外培養(yǎng)和PSP的提取，再投喂給我國兩廣主要的經(jīng)濟(jì)貝類——香港牡蠣(Crassostreahongkongensis)進(jìn)行人工蓄毒，取其內(nèi)臟對PSP結(jié)合蛋白進(jìn)行提取，并逐步通過排阻色譜→離子交換色譜→疏水色譜對PSP結(jié)合蛋白進(jìn)行分離純化，以小鼠生物法(MBA)和液相法(HPLC-FLD)等作為檢測手段確定PSP的位置與組成，再通過SDS-PAGE測定其分子量，又對PSP結(jié)合蛋白進(jìn)行HPLC-M

3、S-MS鑒定，并采用生物信息學(xué)來分析其構(gòu)效，最后研究了PSP結(jié)合蛋白與PSP之間的吸附動力學(xué)。主要結(jié)果如下:
　　(1)為準(zhǔn)備用于香港牡蠣蓄毒培養(yǎng)的微小亞歷山大藻、PSP等樣品，本文對微小亞歷山大藻進(jìn)行培養(yǎng)并采用不同破壁方法:超聲法、微波法和凍融法對PSP進(jìn)行提取。不同方法下提取得到的提取液通過MBA和HPLC-FLD檢測PSP，并確定采用凍融進(jìn)行優(yōu)化試驗(yàn)，得到響應(yīng)面優(yōu)化二次回歸方程為:Y=193.8+13.75A-35.35B+

4、12.58C-20.2AB+6.95AC-13.35BC-38.75A2-78.05B2-51.70C2。驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)確定的最佳條件為:凍融3次，解凍溫度37℃，pH=7.8，提取液的毒力可達(dá)6616±101MU。
　　(2)對香港牡蠣進(jìn)行PSP蓄毒培養(yǎng)，并對其內(nèi)臟進(jìn)行PSP結(jié)合蛋白的分離純化。首先研究不同pH緩沖液對PSP結(jié)合蛋白提取的影響，確定在pH=8下進(jìn)行提取，并通過硫酸銨分級沉淀對PSP結(jié)合蛋白進(jìn)行初步純化，確定硫酸銨飽和度

5、為40％～70％。然后采用逐步分離:首先進(jìn)行S-100分離純化，收集PSP結(jié)合蛋白陽性峰;再對S-100收集得到的PSP結(jié)合蛋白陽性峰進(jìn)行Q-FF分離，進(jìn)行梯度洗脫收集PSP結(jié)合蛋白陽性峰;最后對Q-FF收集得到的PSP結(jié)合蛋白陽性峰進(jìn)行RP-HPLC制備。通過SDS-PAGE對分離純化過程中蛋白組成變化進(jìn)行監(jiān)測，得到所提取的PSP結(jié)合蛋白的分子量為:33.5kDa。
　　(3)將HPLC-MS-MS用于PSP結(jié)合蛋白的鑒定和構(gòu)效

6、分析:①用DNATSAR分析得出其分子量為36.08kDa。該蛋白共含有335個(gè)氨基酸，極性氨基酸和疏水性氨基酸分別占蛋白分子量的38.82％和35.35％，等電點(diǎn)pI=7.25。BLATS分析該蛋白與甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)的同源性高達(dá)78％左右。②利用Predictprotein、NCBI、RPS-BLAST和ConSurf可知其二級結(jié)構(gòu)中α螺旋占28.06％，β折疊占30.75％，無規(guī)則卷曲占41.19％。兩個(gè)結(jié)構(gòu)域?yàn)?/p>

7、GADPH C端區(qū)域家族和GADPH NAD結(jié)合區(qū)域，活性位點(diǎn)位于具有高保守性的148-155位。③GAPDH與PSP中大量酰胺結(jié)構(gòu)具有較高的親和性，進(jìn)一步證明該蛋白為PSP結(jié)合蛋白。
　　(4)最后研究了PSP結(jié)合蛋白（純度為:67.47％）對PSP的吸附動力學(xué)。單因素試驗(yàn)獲得的最佳吸附條件為:pH=9，蛋白濃度3mg/mL，反應(yīng)時(shí)間24h。在此基礎(chǔ)上研究了吸附動力學(xué)，通過動力學(xué)一級和二級方程擬合可知:PSP結(jié)合蛋白對PSP的吸