半夏蛋白的分離純化及結(jié)構(gòu)分析.pdf

1、半夏為天南星科植物半夏(Pinellia ternata(Thunb.)Breit.)的塊莖,是一種重要的中藥材。半夏為廣布物種,主要分布于東南亞地區(qū),國內(nèi)資源豐富,以長江流域居多。半夏內(nèi)用可燥濕化痰,降逆止嘔,消痞散結(jié);外用可用于消炎,另外也可作為殺蟲劑使用。半夏含有多種活性成分,如活性多糖、生物堿、甾醇和半夏蛋白等。近年來研究發(fā)現(xiàn),半夏蛋白是半夏抗腫瘤、抗生育和抗蟲作用的主要有效成分。天然藥物中的有效成分通常十分復雜,而半夏中所含蛋

2、白質(zhì)就不少于十種。隨著半夏蛋白的深入研究,如何獲得大量滿足研究要求的純化半夏蛋白就變的十分重要。目前報道的半夏蛋白純化方法主要包括疏水色譜、親和色譜和離子交換色譜等,但都存在一些缺陷,而不能滿足進一步研究的要求。
　　 本研究在此基礎(chǔ)上,利用凝膠過濾從0.45硫酸銨飽和度鹽析提取的半夏總蛋白中分離得到一種純度僅為80％相對分子量約12KDa的半夏蛋白;又嘗試了Sephadex G-50和MBP Trap HP親和柱組合分離,從0

3、.45～0.8硫酸銨飽和度鹽析提取的半夏總蛋白中先后分離得到兩種半夏蛋白,相對分子量分別約為22KDa和40KDa,純度約90％;但兩種方法重復性均極低,不利于后續(xù)研究。而后,選用了疏水層析直接對0.45硫酸銨飽和度鹽析提取的半夏總蛋白進行分離純化,也得到一種相對分子量約為12KDa的半夏蛋白,雖然重復性提高,純度可達90％,但該方法對操作條件要求極高而不利于大量提純;最后我們根據(jù)半夏凝集素對甘露糖具有專一親和的性質(zhì),以甘露糖為親和配基

4、,環(huán)氧活化瓊脂糖凝膠為介質(zhì),制備了一種甘露糖-Sepharose4B凝膠,并從0.95硫酸銨飽和度鹽析提取蛋白中分離得到純度在95％以上的一種半夏凝集素,其相對分子量為12.165KDa,且重復性高,操作方便,可以大量分離以滿足后續(xù)試驗。研究還發(fā)現(xiàn)該方法受到半夏凝集素與甘露糖配基兩者之間疏水性的直接影響。后續(xù)研究表明該半夏凝集素為一種糖蛋白;能使小白鼠血紅細胞產(chǎn)生凝集反應,最低反應濃度為25μg/ml,而≤12.5μg/ml時小白鼠血紅

5、細胞未見明顯凝集反應;對該半夏凝集素進行的氨基酸組成分析表明該凝集素中含有15種氨基酸,其中天冬氨酸含量最高,半胱氨酸含量最低,與一般植物凝集素相符。本文對半夏凝集素的原核表達及純化做了研究,主要內(nèi)容是利用含半夏凝集素(PTA)基因的表達載體pET-28a(+)轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3),鑒定轉(zhuǎn)化成功后,IPTG誘導表達培養(yǎng),經(jīng)SDS-PAGE分析,存在與預期相符的表達蛋白,相對分子量約為30KDa,且該蛋白為不溶性的包涵體。超聲波