趨化因子受體調(diào)節(jié)劑鈣流篩選模型的建立和應用.pdf

1、趨化因子受體是G蛋白偶聯(lián)受體(G protein coupled receptor，GPCR)超家族的成員之一。G蛋白偶聯(lián)受體是一類重要的藥物靶點，目前針對GPCR常用的檢測方法有放射性配體競爭結合實驗及一些依賴于檢測G蛋白偶聯(lián)受體下游信號通路的功能性實驗等。Ga16作為Gq家族的成員之一，在受體激活后，可以通過第二信使引起胞內(nèi)鈣離子的釋放。本課題基于共表達受體和Ga16蛋白、而測定胞內(nèi)鈣離子信號，分別建立趨化因子受體CCR5和CXCR

2、4的調(diào)節(jié)劑的高通量篩選模型。 1．趨化因子受體CCR5鈣流篩選模型的建立和應用，分為三個小部分． 第一部分，CHO/CCR5/Gαl6穩(wěn)轉細胞株的建立。 方法：電穿孔法將編碼CCR5和Gal6蛋白的基因導入CHO細胞，利用抗性篩選20天左右挑取單克隆擴大培養(yǎng)至形成細胞株，RT-PCR檢測外源蛋白的表達。 結果：RT-PCR檢測到CCR5和Ga16的表達，獲得了穩(wěn)定轉染CCR5和Gαl6的CHO/CCR5/

3、Gαl6細胞株。 第二部分，CHO/CCR5/Gαl6穩(wěn)轉細胞株上CCR5活性的檢測。 方法：[35S]—GTPγs分別檢測CCR5的激動劑RANTES和拮抗劑maraviroc對CCR5的作用。 結果：RANTES能呈劑量依賴性地激活CCR5，maraviroc能劑量依賴性地抑制RANTES對CCR5的激活。提示建立的CHO/CCR5/Gα16細胞株上CCR5具有很好的活性。 第三部分，鈣流篩選模型的建

4、立及應用。 方法： (1)將建立的鈣流模型分為激動劑和拮抗劑兩種模式，分別評價RANTES和maraviroc對受體的作用； (2)分別應用這兩種模式檢測RANTES和maraviroc的劑量反應性，獲得它們的EC50值或IC50值； (3)應用拮抗劑模式評價CCR5拮抗劑先導化合物庫中的一系列化合物。 結果： (1)RANTES激活CCR5，在激動劑模式中檢測到強烈的鈣流信號，而在拮抗劑

5、模式中maraviroc抑制RANTES引起的鈣流反應； (2)鈣流模型獲得的RANTES的EC50值及maraviroc的IC50值與傳統(tǒng)篩選方法得到的結果具有很好的一致性，提示建立的鈣流模型可用于CCR5調(diào)節(jié)劑的高通量篩選； (3)獲得44個對CCR5有較強抑制作用的化合物，再用鈣流模型檢測它們的劑量反應性，得到的IC50值與[35S]—GTPγS結合實驗測得的結果相當且均接近于陽性對照maraviroc。

6、2．趨化因子受體CXCR4鈣流篩選模型的建立，分為三個小部分． 第一部分，CHO/myc—CXCR4/Gα16穩(wěn)轉細胞株的建立。 方法：電穿孔法將編碼myc—CXCR4和Gα16蛋白的基因導入CHO細胞，利用抗性篩選20天左右挑取單克隆擴大培養(yǎng)至形成細胞株，免疫熒光染色實驗檢測定位在細胞膜上的受體。 結果：在獲得的穩(wěn)轉細胞株上，免疫熒光染色檢測到CXCR4定位于細胞膜上。 第二部分，CHO/myc—CXC

7、R4/Gα16穩(wěn)轉細胞株上CXCR4活性的檢測。 方法：[35S]—GTPγS和鈣流實驗檢測CXCR4激動劑SDF-1對CXCR4的作用。 結果：兩種實驗上SDF-1都劑量依賴性地激活CXCR4，且兩種實驗獲得的SDF-1的EC50值較為吻合。提示建立的CHO/myc—CXCR4/Gα16細胞株上CXCR4具有很好的活性。 第三部分，CHO/myc—CXCR4/Gα16細胞株上CXCR4內(nèi)吞、脫敏等信號通路相關事

8、件的探討。 方法： (1)免疫熒光染色實驗檢測SDF-1刺激后引起CXCR4的內(nèi)吞； (2)鈣流實驗檢測SDF-1處理不同時間后CXCR4的脫敏情況； (3)Western blot檢測SDF-1處理不同時間后CXCR4總蛋白的表達量情況。 結果： (1)CXCR4受到SDF-1處理后內(nèi)吞到胞漿內(nèi)； (2)SDF-1刺激5分鐘至24小時，CXCR4均發(fā)生脫敏； (3)SDF

9、-1持續(xù)刺激CXCR4三個小時，即可引起CXCR4表達量下調(diào)。 結論： 1．構建了穩(wěn)定表達外源蛋白趨化因子受體CCR5/CXCR4和Gα16的CHO/CCR5/Gα16和CHO/myc—CXCR4/Gα16細胞株，細胞株中CCR5和CXCR4具有較好的活性。 2．基于共表達受體和Gαl6蛋白建立了激動劑和拮抗劑的兩種鈣流實驗模型，這兩種模式能很好的區(qū)分不同配體對受體的激動或拮抗作用。 3．應用CCR5拮抗