基于衍生化技術(shù)的磷脂高效分析新方法及其應(yīng)用研究.pdf

1、磷脂是生物體內(nèi)種類最多的一類脂質(zhì)，磷脂代謝與許多不同疾病如心血管疾病等密切相關(guān)，是重要的信號(hào)分子。通過了解磷脂化合物在生物體內(nèi)的代謝狀況，結(jié)合磷脂特有的生理功能，進(jìn)而可全面深入地研究磷脂在生命活動(dòng)過程中的作用，對(duì)脂質(zhì)組學(xué)及脂質(zhì)營養(yǎng)的研究具有重要的意義。但是PLs種類極為繁多，結(jié)構(gòu)復(fù)雜，因此對(duì)生物體內(nèi)復(fù)雜磷脂類化合物的分析是一項(xiàng)非常有挑戰(zhàn)性的工作。
　　本課題以磷脂類化合物為研究對(duì)象，將體外化學(xué)衍生化技術(shù)與電噴霧串聯(lián)質(zhì)譜（ESI-M

2、S/MS）技術(shù)相結(jié)合，開展基于化學(xué)衍生化技術(shù)的磷脂高選擇性、高靈敏定性和定量分析新方法研究，以解決現(xiàn)有質(zhì)譜技術(shù)在磷脂分析檢測(cè)中存在的技術(shù)瓶頸。本論文研究結(jié)果如下：
　　1.建立了基于丙酮穩(wěn)定同位素標(biāo)記技術(shù)相對(duì)定量分析磷脂酰乙醇胺（PE）的方法。通過丙酮穩(wěn)定同位素標(biāo)記技術(shù)（ASID），結(jié)合DNLS-shotgun ESI-MS/MS技術(shù)使PE的分析靈敏度提高了2.2-2.5倍。通過d0-丙酮和d6-丙酮衍生化后產(chǎn)生的6Da質(zhì)量差實(shí)現(xiàn)

3、了單個(gè)PE分子種類的相對(duì)定量分析，為解決磷脂分析中定量難的瓶頸問題提供了新思路。應(yīng)用所建方法，完成了對(duì)20％豬油高脂，20%橄欖油高脂喂養(yǎng)和正常飼料喂養(yǎng)大鼠肝臟中 PE分子的定性和相對(duì)定量分析，并通過多變量分析成功的找出了差異顯著的PE分子種類。分析結(jié)果對(duì)高脂膳食引發(fā)的慢性疾病相關(guān)脂質(zhì)類生物標(biāo)志物的發(fā)掘具有指導(dǎo)意義。
　　2.丙酮雖然常見易得，但它只能針對(duì)PE、PS等含有氨基的磷脂種類進(jìn)行衍生化反應(yīng)。因此，本章又建立了一種基于甲基

4、化和同位素標(biāo)記技術(shù)的磷脂高效定性定量分析方法。一方面通過“輕”，“重”標(biāo)記后的目標(biāo)分析物按等比例混合實(shí)現(xiàn)了PLs的相對(duì)定量分析；另一方面，通過以“輕”標(biāo)記的磷脂標(biāo)準(zhǔn)品作為內(nèi)標(biāo)，實(shí)現(xiàn)了PLs的絕對(duì)定量分析。此外，三甲基硅烷化重氮甲烷對(duì)磷脂甲基化后，PC、PE、PS、PA、PG和PI六類磷脂的檢測(cè)靈敏度分別提高了1.18-，10.21-，10.21-，14.03-，104.13-及7.28倍。通過基于混合模式固相萃取技術(shù)可快速分離血漿磷脂，

5、結(jié)合所建立的基于甲基化和穩(wěn)定同位素標(biāo)記技術(shù)的磷脂高效高通量分析方法，對(duì)高血脂病人血漿中磷脂組分含量的變化進(jìn)行分析。共鑒定出血漿中的33種PC，25種PE，22種PG，15種PS，17種PI和18種PA，且找出了30種具有顯著差異的磷脂分子種類。并進(jìn)一步驗(yàn)證了基于甲基化和同位素標(biāo)記技術(shù)的磷脂相對(duì)定量和絕對(duì)定量分析方法的可行性和實(shí)用性。所建立的磷脂分析方法簡單實(shí)用，拓寬了內(nèi)標(biāo)物的選擇范圍，對(duì)脂質(zhì)組學(xué)和脂質(zhì)化學(xué)與營養(yǎng)的研究都具有重要意義。

6、r>　　3.建立了結(jié)構(gòu)磷脂的shotgun-MS分析方法。應(yīng)用該方法結(jié)合單因素實(shí)驗(yàn)和響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)研究了酶法合成富含花生四烯酸結(jié)構(gòu)磷脂的工藝。得出最佳的工藝條件為：反應(yīng)溫度55.6℃，反應(yīng)時(shí)間25.1 h，酶添加量15.3%，底物摩爾比1:10.1。在此最優(yōu)條件下，ARA結(jié)合率可達(dá)15.42%，富含ARA結(jié)構(gòu)磷脂的產(chǎn)率為13.26%。并對(duì)合成產(chǎn)物中的卵磷脂（PC）分子種類進(jìn)行了鑒定。該研究為富含n-6系列PUFA結(jié)構(gòu)磷脂的營養(yǎng)學(xué)特性研究及相