基于微流控芯片的濃度梯度實(shí)現(xiàn)新方法及其應(yīng)用研究.pdf

1、生物體能夠感受周圍環(huán)境中多種化學(xué)分子信號(hào),并根據(jù)其濃度梯度改變自身的生理活動(dòng)。傳統(tǒng)的研究生物體對(duì)于外界環(huán)境反應(yīng)的方法操作繁瑣、耗時(shí)較長、難以定量分析、并且不具有通用性。微流控芯片技術(shù)能夠?qū)⒉煌牟僮髡显谝粔K芯片內(nèi),從而實(shí)現(xiàn)分析設(shè)備的微型化、集成化、自動(dòng)化,將可以解決傳統(tǒng)方法難以解決的生物學(xué)問題。因此,利用微流控芯片模擬外界環(huán)境,建立化學(xué)物質(zhì)濃度梯度,并在細(xì)胞以及個(gè)體水平上研究生物體對(duì)于外界環(huán)境的反應(yīng)無疑具有重要的意義。
　　本文

2、建立了一種新型濃度梯度微流控芯片。不同于已報(bào)道的常見的“圣誕樹”的濃度梯度形成結(jié)構(gòu),該芯片利用階梯狀微通道網(wǎng)絡(luò),采用了逐步分流再混流的方式逐步稀釋樣品溶液,從而產(chǎn)生液體濃度梯度。
　　我們首先對(duì)該微流控芯片進(jìn)行理論分析與優(yōu)化。采用數(shù)學(xué)建模的方法對(duì)這種通過液體串行稀釋而產(chǎn)生化學(xué)物質(zhì)濃度梯度的微流控新方法進(jìn)行了原理闡述。通過流體力學(xué)計(jì)算方法,對(duì)微流控芯片內(nèi)微通道結(jié)構(gòu)進(jìn)行了數(shù)學(xué)建模,并模擬分析不同的結(jié)構(gòu)對(duì)于濃度梯度的影響。結(jié)果表明采用微

3、通道寬度為100μm、下層主通道液體分流的分叉口處于右位、入口流量為0.5μL/min時(shí)的階梯狀網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)最有利于形成液體濃度梯度。
　　為了驗(yàn)證數(shù)學(xué)模擬的結(jié)果,我們?cè)谛酒肟诜謩e通入水和熒光素,并通過熒光顯微鏡進(jìn)行成像分析。結(jié)果表明在芯片內(nèi)混流的區(qū)域,水和熒光素實(shí)現(xiàn)了完全混合,并在出口的六條微通道處形成了線性濃度梯度。在出口主通道中,六路溶液呈現(xiàn)層流特性,形成了明顯的穩(wěn)定的濃度梯度,保持了較長距離。實(shí)驗(yàn)結(jié)果與流體動(dòng)力學(xué)計(jì)算得到的模

4、擬結(jié)果非常吻合。
　　之后,我們利用該微流控芯片進(jìn)行了細(xì)胞水平上的應(yīng)用。表達(dá)有可以檢測(cè)細(xì)胞凋亡的CD2探針的HeLa細(xì)胞通過正壓從芯片出口處進(jìn)入主通道內(nèi),并貼附其通道壁生長。通過該芯片微通道網(wǎng)絡(luò)在主通道中形成穩(wěn)定的抗癌藥物—順鉑濃度梯度,從而實(shí)現(xiàn)不同濃度的順鉑藥物對(duì)細(xì)胞的處理。利用熒光能量共振轉(zhuǎn)移成像系統(tǒng)對(duì)順鉑誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的進(jìn)行實(shí)時(shí)在體監(jiān)測(cè)。實(shí)驗(yàn)表明:順鉑可以誘導(dǎo)HeLa細(xì)胞凋亡,且順鉑的濃度與細(xì)胞凋亡率呈正相關(guān),其中蛋白酶Cas

5、pase-2介導(dǎo)了順鉑誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。這些結(jié)果說明該微流控濃度梯度產(chǎn)生芯片可以用于細(xì)胞凋亡的研究。
　　最后,我們利用該微流控芯片形成了傳統(tǒng)方法難以實(shí)現(xiàn)的含有濃度梯度的線蟲培養(yǎng)環(huán)境,并分析了線蟲對(duì)于NaCl的趨向性以及趨向?qū)W習(xí)行為。通過正壓,我們將線蟲直接注入芯片內(nèi)出口主通道中,并通過芯片內(nèi)階梯狀微通道網(wǎng)絡(luò)在主通道中形成NaCl濃度梯度。為定量分析芯片內(nèi)線蟲的化學(xué)物質(zhì)趨向性行為,我們通過成像,分析了在出口主通道中不同NaCl濃度區(qū)

6、域內(nèi)的線蟲分布。結(jié)果表明野生型線蟲主要趨向于濃度大于20mM的NaCl溶液,對(duì)于50-100mM之間的NaCl溶液沒有偏好性,對(duì)高于300mM的NaCl溶液則表現(xiàn)出明顯的厭惡性行為。此外,我們?cè)谠撔酒瑑?nèi)直接實(shí)現(xiàn)了NaCl與饑餓共處理線蟲,從而將線蟲的學(xué)習(xí)訓(xùn)練與訓(xùn)練后趨向性分析同在一塊芯片內(nèi)進(jìn)行。結(jié)果表明:類似于平板上的學(xué)習(xí)行為,NaCl與饑餓共處理的線蟲表現(xiàn)出厭惡原來喜歡的低濃度的NaCl的行為。這種芯片內(nèi)學(xué)習(xí)方式可以讓線蟲通過學(xué)習(xí)建立

7、低濃度NaCl與厭惡行為的聯(lián)系。因此,該芯片可以為研究線蟲的化學(xué)物質(zhì)趨向以及學(xué)習(xí)行為提供良好的研究平臺(tái),并能夠提高分析效率,降低分析時(shí)間,可以分析記憶時(shí)間很短的線蟲可塑性學(xué)習(xí)行為。
　　上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明該微流控新技術(shù)平臺(tái)具有設(shè)計(jì)新穎、結(jié)構(gòu)簡單以及實(shí)現(xiàn)效果明顯的特點(diǎn),能夠?qū)崿F(xiàn)可控的化學(xué)物質(zhì)濃度梯度,并能夠應(yīng)用于不同的生物體系中。除了形成濃度梯度,該方法還可以形成溫度梯度,為將來研究細(xì)胞和多細(xì)胞生物體在不同溫度條件下的反應(yīng)提供一種新的