梯度稀釋補料酶膜耦合反應制備牛奶蛋白ACE抑制肽的研究.pdf

1、為了研究和探索一種制備牛奶蛋白ACE抑制肽的最佳酶膜耦合工藝模型，本文在傳統(tǒng)酶解和不補料酶膜耦合最優(yōu)工藝基礎上，對比性探究了等濃度補料、先補料后補水和梯度稀釋補料三種酶膜耦合反應過程的穩(wěn)定性及酶解效果，并對梯度稀釋補料酶膜耦合的酶解動力學及穩(wěn)定運行試驗進行了探究。具體研究內容如下：
　　以脫脂奶粉為原料，對5種蛋白酶進行篩選，以ACE抑制率和IC50為考察指標，確定中性蛋白酶為本試驗用酶。利用單因素試驗、正交試驗優(yōu)化酶解條件，得出

2、最優(yōu)反應條件為：反應時間60 min、底物濃度11％、加酶量2000 U/g、溫度50℃、pH7.0。
　　以膜通量、ACE抑制率和IC50為指標，確定超濾膜分子量為5 kDa。通過不補料酶膜耦合單因素試驗，得到酶膜耦合反應最優(yōu)工藝為：底物濃度7%、加酶量2000 U/g、反應時間100 min、循環(huán)泵轉速100 r/min，在該條件下蛋白轉化率為53.16%、ACE抑制率為76.81%，單位酶產肽量為39.59 g肽·(g酶)-

3、1。與對照比較，蛋白轉化率、ACE抑制率、單位酶產肽量分別提高16.99%、18.55%、16.61%。采用高效凝膠過濾色譜法測定超濾液中ACE抑制肽的分子量分布，3 kDa以下組分質量分數(shù)為86.60%。
　　繪制三種補料模式下的酶膜耦合反應進程曲線，結果表明，等濃度補料穩(wěn)定性最差，先補料后補水穩(wěn)定性較差，梯度稀釋補料反應最為穩(wěn)定。梯度稀釋補料反應體系具有透過液濃度高（12.748 mg/mL）、膜通量變化幅度最?。?20.40

4、3 mL·(m2·min)-1左右）、反應器內蛋白濃度相對穩(wěn)定（22.637 mg/mL）等優(yōu)點。對比三種補料模式酶解效果，梯度稀釋補料模式蛋白轉化率和多肽得率最高，分別是67.58%、67.07%；比先補料后補水模式分別提高12.35%、9.93%；比等濃度補料模式分別提高62.30%、34.03%。因此，梯度稀釋補料酶膜耦合反應，穩(wěn)定性好，酶解效率高，是一種酶解蛋白制取活性多肽的有效手段。
　　在梯度稀釋補料酶膜耦合酶解過程中

5、，擬合水解度DH與底物濃度S0及水解時間t的關系，可據(jù)此預測其他S0下DH隨時間的變化情況。基于對酶解機制的合理假設，建立梯度稀釋補料酶膜耦合反應過程動力學模型，得動力學常數(shù)Km=69.481 g/L，Vmax=0.752 g·l-1 min-1，對不同底物濃度下梯度稀釋補料酶膜耦合反應過程進行模擬，實驗值與模擬值吻合較好。通過米氏常數(shù)確認最優(yōu)底物濃度為70 g/L。
　　在動力學模型得出的最佳底物濃度下，梯度稀釋補料酶膜耦合反應

6、可持續(xù)運行720 min，酶解結果如下：蛋白轉化率74.51%、多肽得率75.13%、單位酶產肽量142.27 g肽·(g酶)-1、IC500.77 mg/mL；粗肽產品灰分為8.04%、水分為11.68%、多肽含量為37.40%。
　　綜上所述，梯度稀釋補料酶膜耦合模型既克服了酶利用率低和反應后期底物不足等問題，又吸取了多種酶膜耦合補料方式的優(yōu)點，可顯著提高酶利用率和生產效率，為工業(yè)化生產牛奶蛋白ACE抑制肽提供一種更為有效的方