上調(diào)表達(dá)ChM-I的大鼠MSCs向軟骨細(xì)胞分化的研究.pdf

1、研究目的:探索ChM-Ⅰ的上調(diào)表達(dá)誘導(dǎo)MSCs向軟骨細(xì)胞方向分化的作用。
　　 研究方法:
　　 1.密度梯度離心法獲得大鼠MSCs，傳代培養(yǎng)并擴(kuò)增。使用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞表面抗原(CD90、CD29)。將凍存的穩(wěn)轉(zhuǎn)pcDNA3.1(+)/ChM-Ⅰ質(zhì)粒的MSCs和穩(wěn)轉(zhuǎn)pcDNA3.1(+)質(zhì)粒的MSCs復(fù)蘇及擴(kuò)培。
　　 2.高糖DMEM無(wú)血清特定培養(yǎng)誘導(dǎo)液（含10ng/mlTGF-β1、100nmol/L地塞

2、米松、50umol/ml抗壞血酸、1％ITS）
　　 3.實(shí)驗(yàn)分六組(1):實(shí)驗(yàn)1組(穩(wěn)定轉(zhuǎn)染表達(dá)載體pcDNA3.1(+)/ChM-Ⅰ的MSCs細(xì)胞組）(2):實(shí)驗(yàn)2組(穩(wěn)定轉(zhuǎn)染表達(dá)載體pcDNA3.1(+)/ChM-Ⅰ的MSCs細(xì)胞+誘導(dǎo)液組）(3):對(duì)照1組（正常MSCs組）(4):對(duì)照2組（正常MSCs+誘導(dǎo)液組）(5):對(duì)照3組(穩(wěn)定轉(zhuǎn)染表達(dá)載體pcDNA3.1(+)的MSCs細(xì)胞組）(6):對(duì)照4組(穩(wěn)定轉(zhuǎn)染表達(dá)載體

3、pcDNA3.1(+)的MSCs+誘導(dǎo)液組），細(xì)胞培養(yǎng)至7天、14天、21天三個(gè)時(shí)間點(diǎn)，通過(guò)使用倒置顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)的改變;甲苯胺藍(lán)染色檢測(cè)軟骨基質(zhì)的分泌情況;免疫細(xì)胞化學(xué)檢測(cè)軟骨特異性Ⅱ型膠原的表達(dá)情況。通過(guò)以上實(shí)驗(yàn)方法說(shuō)明表達(dá)ChM-Ⅰ的大鼠MSCs細(xì)胞株具有向軟骨細(xì)胞分化的能力。
　　 研究結(jié)果:
　　 1.MSCs細(xì)胞株的擴(kuò)增培養(yǎng)及鑒定:
　　 單細(xì)胞懸液接種48h后換液，倒置顯微鏡觀察并拍照:可于培養(yǎng)

4、皿底部見(jiàn)到呈梭形或三角形的貼壁細(xì)胞，培養(yǎng)11～13天后培養(yǎng)皿底部細(xì)胞密度達(dá)到85％以上。通過(guò)傳代，細(xì)胞在6h內(nèi)可達(dá)80％以上貼壁，細(xì)胞生長(zhǎng)速度加快，可見(jiàn)細(xì)胞呈成纖維細(xì)胞樣生長(zhǎng)，折光性較強(qiáng)，群落呈魚群樣。流式細(xì)胞儀鑒定結(jié)果:MSCs陽(yáng)性表面抗原CD90、CD29的表達(dá)率分別為99.79％、98.41％;MSCs陰性表面抗原CD45、CD11b/c的表達(dá)率分別為2.77％、2.51％。提示MSCs達(dá)到實(shí)驗(yàn)要求。
　　 2.凍存的穩(wěn)定

5、轉(zhuǎn)染表達(dá)載體pcDNA3.1(+)/ChM-Ⅰ的MSCs細(xì)胞組和穩(wěn)定轉(zhuǎn)染表達(dá)載體pcDNA3.1(+)的MSCs細(xì)胞組復(fù)蘇及擴(kuò)培:常規(guī)復(fù)蘇后，通過(guò)增值、傳代，細(xì)胞生長(zhǎng)旺盛，排列密集整齊，呈編織狀、旋渦狀。
　　 3.六組細(xì)胞甲苯胺藍(lán)染色和Ⅱ型膠原免疫組化結(jié)果及分析:
　　 實(shí)驗(yàn)2組誘導(dǎo)后的細(xì)胞和3個(gè)對(duì)照組的細(xì)胞由梭形向多邊形轉(zhuǎn)變。甲苯胺藍(lán)染色和Ⅱ型膠原免疫組化結(jié)果顯示:對(duì)照1、3組檢測(cè)的特異性軟骨基質(zhì)的分泌和軟骨Ⅱ型膠原

6、的表達(dá)均為陰性;實(shí)驗(yàn)1組和對(duì)照2、4組均檢測(cè)存在特異性軟骨基質(zhì)的分泌和軟骨型Ⅱ膠原的表達(dá)，但實(shí)驗(yàn)1組為弱陽(yáng)性，對(duì)照2、4組為陽(yáng)性，說(shuō)明ChM-Ⅰ的上調(diào)表達(dá)可誘導(dǎo)MSCs向軟骨細(xì)胞分化，但不及TGF-β1的效率;實(shí)驗(yàn)2組檢測(cè)軟骨基質(zhì)的分泌和軟骨Ⅱ型膠原的表達(dá)呈強(qiáng)陽(yáng)性，優(yōu)于對(duì)照2、4組;實(shí)驗(yàn)2組和實(shí)驗(yàn)1組均能檢測(cè)到特異性軟骨基質(zhì)的分泌和軟骨Ⅱ型膠原的表達(dá)，且實(shí)驗(yàn)2組優(yōu)于實(shí)驗(yàn)1組;說(shuō)明穩(wěn)定轉(zhuǎn)染表達(dá)載體pcDNA3.1(+)/ChM-Ⅰ的MSC