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文檔簡介
1、第一部分:免疫性血小板減少癥患者糖皮質(zhì)激素受體亞型表達及與激素抵抗相關(guān)性的研究
目的:
探討初治成人原發(fā)性免疫性血小板減少癥(ITP)患者外周血單個核細胞(PBMC)糖皮質(zhì)激素受體(GR)亞型α、β、γ和p的表達及與糖皮質(zhì)激素(GC)抵抗的關(guān)系,為逆轉(zhuǎn)GC抵抗及實現(xiàn)ITP的個體化治療提供線索及依據(jù)。
方法:
連續(xù)選取2009年2月~2011年7月大連醫(yī)科大學附屬一院血液科住院初治I
2、TP患者62例(女性39例,男性23例,中位年齡37歲),健康對照者38例(女性25例,男性13例,中位年齡34歲)為研究對象。其中39例ITP患者接受了GC治療,根據(jù)GC療效分為GC敏感組(GCS)28例(女性20例,男性8例,中位年齡33歲)和GC抵抗組(GCR)11例(女性7例,男性4例,中位年齡44歲)。
1.采集晨空腹肘靜脈血5ml,采用Ficoll密度梯度離心法分離PBMC。應(yīng)用實時熒光定量PCRSYBRGre
3、en染料法檢測患者和正常人GRα、GRβ、GRγ和GRpmRNA的表達。比較患者組與正常組,GCS組和GCR組GR亞型表達的差異。分析患者組和正常組,GCS組和GCR組四種受體亞型總和組間表達差異。
2.分析各受體亞型間及與患者病初血小板水平的相關(guān)性。
3.采用Westernblot方法檢測ITP患者GCS組20例、GCR組8例和正常人組20例PBMC中GRα和GRβ蛋白的表達,并比較組間差異。
4、 結(jié)果:
患者組和正常組GR亞型表達為非正態(tài)分布數(shù)據(jù),用中位數(shù)(四分位數(shù)間距)表示,其中患者組表達差異大于正常對照組。
1.患者組4種GR亞型總和為5.17(1.85-17.36),顯著高于正常人組2.89(1.24-8.01)(P<0.05),其中GRα和GRβmRNA的表達較正常組有顯著升高(P<0.05),患者組GRαmRNA為1.20(0.42-3.27),正常組為0.96(0.31-1.46);患者
5、組GRβmRNA為0.06(0.00-0.45),正常組為0.02(0.00-0.05)。GCS組和GCR組4種受體亞型總和無顯著差異。GRβ、γ、p含量較低,在部分患者無法測出。患者組與正常組GRγ和GRpmRNA表達無顯著差異。
2.GCS組和GCR組GRα、GRβ、GRγ和GRpmRNA的表達均無顯著差異(P>0.05),但GRα在GCS組為1.11(0.30-2.69),GCR組為0.80(0.34-3.05),在
6、GCS組呈升高趨勢;GRγ在GCS組為0.20(0.05-1.41),GCR組為0.27(0.00-3.23),GRγ在GCR組呈升高趨勢。
3.患者GRp表達與GRα、GRp與GRβ、GRp與GRγmRNA表達均呈正相關(guān)(P<0.05),其中GRp與GRα相關(guān)性及相關(guān)系數(shù)最大(r=0.58,P<0.01)。其它受體亞型之間及各受體亞型與病初血小板水平無明顯相關(guān)性。
4.GCS組GRα蛋白顯著高于GCR組(P
7、<0.05),GCS組、GCR組分別與正常組比較無顯著差異。GRβ蛋白在3組間均未測出。
結(jié)論:
1.ITP患者的受體亞型數(shù)據(jù)范圍較大,而正常人亞型表達相對穩(wěn)定,數(shù)據(jù)范圍較小,提示患者的GR亞型可能受多種因素調(diào)控,且ITP是一種異質(zhì)性疾病。
2.初治ITP患者存在GR表達上調(diào),以GRα和GRβ升高為主。
3.ITP患者GC抵抗與GRα蛋白的表達成負相關(guān),可能與GRγ成正相關(guān)。
8、> 4.GRβmRNA含量極低,在蛋白水平未檢測出,提示ITP患者的GC抵抗與GRβ無關(guān)。
5.GRpmRNA與GRαmRNA相關(guān)性及相關(guān)系數(shù)最大,為正相關(guān),結(jié)合GRαmRNA在敏感組呈升高趨勢,GRα蛋白在敏感組顯著升高,推測GRp可能介導GC效應(yīng),有待進一步擴大研究。
第二部分:熱休克蛋白90及轉(zhuǎn)錄因子NF-κB、AP-1與糖皮質(zhì)激素抵抗相關(guān)性的研究
目的:
探討原發(fā)免疫
9、性血小板減少癥(ITP)患者糖皮質(zhì)激素受體分子伴侶熱休克蛋白90(HSP90)、核轉(zhuǎn)錄因子-κB(NF-κB)和激活蛋白-1(AP-1)表達特點及與激素療效、部分臨床指標的相關(guān)性。
方法:
連續(xù)選取2009年2月~2011年7月大連醫(yī)科大學附屬一院血液科住院初治ITP患者44例,健康對照者32例為研究對象。
1.抽取晨空腹肘靜脈血5ml,采用Ficoll密度梯度離心法分離單個核細胞。采用實時熒光
10、定量PCR方法檢測患者外周血單個核細胞(PBMC)HSP90mRNA,比較組間差異。將患者按糖皮質(zhì)激素(GC)治療效應(yīng)分為GC敏感組(GCS)和GC抵抗組(GCR),再按年齡、性別、病程和病情進行分亞組比較。
2.40例ITP患者和29例正常人前期已進行GRαmRNA檢測,其中GCS組24例、GCR組7例,分析HSP90/GRα在患者組和正常組間的差異及與GC效應(yīng)的相關(guān)性。
3.分析患者HSP90mRNA表達
11、量與病初血小板數(shù)、骨髓巨核細胞數(shù)及血小板抗體IgG的相關(guān)性。
4.應(yīng)用Westernblot方法檢測20例GC敏感患者、6例GC抵抗患者和20例正常人PBMC核蛋白P65/NF-κB和C-Jun/AP-1蛋白表達,比較組間差異。
結(jié)果:
1.44例ITP患者HSP90mRNA中位數(shù)為0.90(0.48-2.52),32例正常人為1.40(0.82-2.65),正常人表達較患者有升高趨勢,但兩組無
12、統(tǒng)計學差異(P>0.05)。
2.成人急性ITP患者HSP90mRNA表達顯著高于慢性患者(P<0.05)。GCS組表達較GCR組有升高趨勢,但無統(tǒng)計學差異(P>0.05)。再按性別、年齡和病情分組比較,可見女性較男性患者,年齡≤60歲較年齡>60歲患者,輕型較重型患者,HSP90mRNA均有升高趨勢,但亦無統(tǒng)計學差異(P>0.05)。
3.患者組較正常組GRαmRNA呈升高趨勢,HSP90/GRα呈下降趨勢
13、(P=0.09)。GCS組和GCR組GRαmRNA的表達和HSP90/GRα均無顯著差異(P>0.05),但HSP90/GRα在GCR組呈升高趨勢。
4.患者HSP90mRNA表達量與病初血小板數(shù)、骨髓巨核細胞數(shù)及血小板抗體IgG無明顯相關(guān)性。
5.P65/NF-κB在GCR組表達顯著高于GCS組(P<0.05),在正常人組的表達亦顯著高于GCS組(P<0.05),GCR組和正常人組的表達無顯著差異。C-Ju
14、n蛋白的表達3組間無顯著差異。
結(jié)論:
1.ITP患者HSP90mRNA表達較正常人組呈下降趨勢,結(jié)合第一部分研究患者GRαmRNA表達顯著高于正常組,提示HSP90mRNA可能介導GC效應(yīng)。
2.HSP90mRNA與ITP患者病程密切相關(guān),急性期患者表達下降,且男性、高齡、重型、慢性患者較女性、低齡、輕型患者HSP90mRNA表達均有下降趨勢,而前者均易發(fā)生GC抵抗,提示HSP90與GC療效可
15、能成正相關(guān)。
3.NF-κB高表達與GC抵抗有關(guān)。AP-1可能不介導ITP的GC效應(yīng)。
第三部分CD4+T淋巴細胞功能變化在ITP發(fā)病中作用的初步研究
背景及目的:
除了體液免疫機制以外,細胞免疫機制在ITP發(fā)病中亦起重要作用,其中包括T淋巴細胞亞群和功能的改變。CD4+T淋巴細胞功能失調(diào)的研究日漸深入,CD4+T淋巴細胞可分為Th1、Th2、調(diào)節(jié)T細胞(T-reg)和Th17四類
16、。它們通過分泌不同的細胞因子介導免疫反應(yīng)。本研究通過檢測ITP患者和正常人血漿上述細胞亞群所分泌細胞因子含量,探討CD4+T淋巴細胞亞群功能失調(diào)在ITP發(fā)病中的作用。
方法:
連續(xù)選取2009年10月~2011年9月大連醫(yī)科大學附屬一院血液科住院ITP患者52例,健康對照者30例為研究對象。抽取晨空腹肘靜脈血5ml,分離血漿。選擇Th1細胞分泌的IL-2、IFN-γ,Th2細胞分泌的IL-4、IL-10,T-
17、reg細胞分泌的TGF-β1,Th17細胞分泌的IL-17為研究對象。
1.采用ELISA方法檢測52例ITP患者和30例正常人血漿中上述細胞因子濃度,比較患者組與正常組間差異。將患者組按年齡、性別、病程、病情、既往治療與否進行再分組,比較亞組間上述細胞因子濃度差異。
2.將患者細胞因子濃度與病初血小板數(shù)、骨髓巨核細胞數(shù)和血小板抗體IgG(PAIgG)進行相關(guān)性分析。
結(jié)果:
1.
18、患者組IL-4和IL-10表達顯著高于正常組(P<0.05),而IFN-γ、IL-2、TGF-β1和IL-17顯著低于正常組(P<0.05)。
2.亞組分析比較發(fā)現(xiàn)僅IL-17在慢性ITP患者中的血漿濃度顯著高于急性患者(P<0.05)。其它細胞因子在亞組間比較及IL-17在其它亞組間比較無顯著差異。
3.患者血漿IFN-γ濃度與PAIgG量呈正相關(guān)(r=0.48,P=0.02)。其它細胞因子與血小板數(shù)、骨髓
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